Irisin 對H9C2 心肌細胞缺氧復氧損傷后的保護作用

吳 娟 張曉萌 常 盼 朱肖星 李 靜 王西輝 王建榜 于 軍

1.西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院全科醫(yī)學科暨陜西省心血管內科疾病臨床研究分中心，陜西西安 710038；2.空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院超聲科，陜西西安 710036；3.西安國際醫(yī)學中心臨床實驗中心，陜西西安 710100

心肌缺血再灌注損傷在心肌梗死發(fā)生過程中及其細胞凋亡、結構重塑、炎性反應的發(fā)生中都發(fā)揮重要作用[1]。過氧化物增殖子激活-受體因子γ 輔激活因子（PGC-1α）是改善缺血再灌注損傷的重要分子，PGC-1α 通過改善能量代謝，線粒體融合、分裂、新生，調節(jié)細胞氧化-抗氧化平衡等功能改善再灌注損傷發(fā)生時的能量耗竭，氧自由基堆積和線粒體結構及功能受損等病理生理過程，顯著改善缺血再灌注損傷后的心肌細胞預后。鳶尾素（Irisin）是運動后肌肉中PGC-1α 表達激活，導致下游產生膜蛋白纖維連結蛋白Ⅲ型域包含蛋白5（FNDC5），F(xiàn)NDC5 經(jīng)過剪切后產生的一種激素[2]。Irisin 可促進干細胞向骨細胞分化，促進脂肪細胞棕色化，降低成熟脂肪細胞數(shù)量，并可以改善脂肪、心肌、骨骼肌等多種細胞的代謝[3]。有研究[4]報道，血清中Irisin 的含量與心力衰竭嚴重程度相關，而Irisin 在心肌缺血再灌注損傷過程中的作用很少被研究。為此，本研究探究Irisin 在心肌細胞缺氧復氧過程中的保護作用。

1 材料與方法

1.1 細胞模型的建立及實驗分組

H9C2 細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內，每孔加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細胞生長至鋪滿底面80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，接種于6 孔板或96 孔板中，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。實驗分為對照組，對照+Irisin 組，缺氧復氧組，缺氧復氧+Irisin 組，Irisin濃度為10 ng/mL。分別處理，正常培養(yǎng)的細胞作為對照組，在對照組中加入10 ng/mL 的Irisin 作為對照+Irisin 組，細胞行缺氧復氧處理作為缺氧復氧組，細胞進行缺氧復氧處理后再加入10 ng/mL 的Irisin 為缺氧復氧+Irisin 組。

1.2 H9C2 細胞的缺氧復氧

將對數(shù)生長期的H9C2 細胞換為無血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，放入含有95% N2、5% CO2的三氣培養(yǎng)箱中（三洋，日本）進行缺氧4 h 處理，而后放入含5%CO2的培養(yǎng)箱中進行復氧2 h 處理。

1.3 細胞活力檢測

將細胞接種于96 孔板中，處理結束后，棄去培養(yǎng)基，用預熱后的PBS 緩沖液沖洗3 次，每孔加入100 μL的DMEM 無血清培養(yǎng)基和10 μL 的CCK-8 試劑（碧云天生物有限公司），混勻后避光置于37℃恒溫搖床進行孵育45 min，BioTek 酶標儀于470 nm 檢測吸收光值。

1.4 ROS 檢測

收集各組細胞后，用預熱后的PBS 緩沖液沖洗3 次，每孔加入2 mL 的DMEM 無血清培養(yǎng)基和1 μL的DCFH-DA 試劑（南京建成生物有限公司），混勻后避光置于37℃恒溫搖床進行孵育30 min，用0.25%的胰蛋白酶消化后，收集細胞懸液于15 mL 離心管中，800 g 常溫離心5 min，棄去上清，重懸后鋪板加入檢測液，在550 nm 檢測吸光值。

1.5 JC-1 的檢測

收集各組細胞后，依次加入1 mL JC-1 染色工作液（碧云天生物有限公司），充分混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min 后棄上清，用JC-1 染色緩沖液洗滌2 次，加入2 mL 細胞培養(yǎng)液，用流式細胞儀FL2 通道檢測。

1.6 RT-PCR 檢測凋亡相關基因

細胞總RNA 的提取使用TRIzol 試劑（Takara，日本），反轉錄以及RT-PCR 依照TaKaRa 公司Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR的說明書進行操作，主要包括去除基因組DNA，反轉錄反應及RT-PCR 反應[5]。反應條件為預變性95℃（30 s），變性95℃（5 s），退火56℃（30 s），重復變性和退火步驟40 次，解離95℃（15 s）。引物構建由上海生工完成，引物序列分別為，caspase-3 正向引物5′-GGACTGCGGTATTGAGA-3′，反向引物5′-GGTGCGGTAGAGTAAGC-3′；caspase-9 正向引物5′-GTGAAGAACGACCTGACT-3′，反向引物5′-AGGATGACCACCACAAAG-3′及β-actin 正向引物5′-TGCCCATCTATGAGGGTTACG-3′，反向引物5′-TAGAAGCATTTGCGGTGCACG-3′。

1.7 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Irisin 對心肌細胞活力的影響

通過CCK-8 檢測心肌細胞活力，對照+Irisin 組的細胞活力與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；缺氧復氧組的細胞活力較對照組顯著降低（P＜0.01）；缺氧復氧+Irisin 組較缺氧復氧組細胞活力增加（P＜0.05）。見圖1。

圖1 細胞活力的檢測（n=6）

2.2 Irisin 對心肌細胞ROS 含量的影響

對照+irisin 組的細胞活力與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；缺氧復氧組ROS 水平高于對照組（P＜0.01）；缺氧復氧+Irisin 組ROS 含量低于缺氧復氧組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 ROS 的檢測（n=6）

2.3 Irisin 對心肌細胞線粒體膜電位的影響

缺氧復氧組JC-1 低于對照組（P＜0.05）；缺氧復氧+Irisin 組JC-1 高于缺氧復氧組（P＜0.05），對照組與對照+Irisin 組JC-1 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

2.4 Irisin 對細胞凋亡相關基因表達的影響

對照組與對照+Irisin 組caspase-3 及caspase-9水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；缺氧復氧組caspase-3 及caspase-9 水平高于對照組（P＜0.05）；缺氧復氧+Irisin 組caspase-3 及caspase-9 水平顯著低于缺氧復氧組（P＜0.05）。見圖4。

圖3 流式細胞技術檢測JC-1 含量（n=3）

3 討論

圖4 凋亡相關基因caspase-3 和caspase-9 的表達（n=6）

近年來，隨著城鄉(xiāng)居民生活水平進一步提高，我國心血管疾病的發(fā)生率屢創(chuàng)新高。由供氧不足引起的心臟缺血可導致心肌缺血/再灌注損傷的發(fā)生，是導致心血管疾病死亡率和發(fā)病率升高的主要原因[6]。由冠狀動脈部分或完全閉塞引起的心肌缺血以及隨后的血流恢復引起的額外心臟損傷（缺血/再灌注損傷）是全世界死亡的主要原因[7]。心肌缺血/再灌注損傷的潛在病理生理學可能涉及許多因素，如活性氧形成[8]、心臟能量代謝改變[9]、細胞凋亡激活[10]和炎性反應[11]。有氧運動時，肌肉收縮激活PGC-1α 的表達，進一步刺激FNDC5 表達，位于細胞膜上的FNDC5 蛋白經(jīng)過剪切后成為Irisin 入血[12]。Irisin 在改善代謝、抗凋亡、調節(jié)免疫系統(tǒng)等方面均可發(fā)揮重要作用[13]。近年來越來越多的證據(jù)顯示，Irisin 與心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關[14]，有望成為急性冠脈綜合征的新的靶點分子[15]。但其具體機制，尤其是在心血管系統(tǒng)疾病的機制很少報道。本研究利用大鼠心肌細胞H9C2 中行缺氧復氧處理，以探究Irisin 對心肌缺氧復氧的作用以及相關的作用機制，以期對臨床的進一步應用研究提供理論依據(jù)。

心肌細胞的缺血再灌注損傷主要的發(fā)生機制包括自由基的形成、鈣超載作用、白細胞炎性反應、高能磷酸化合物缺乏等。在缺氧條件下，細胞內的ATP 減少，無法將黃嘌呤氧化酶轉化為次黃嘌呤氧化酶，當再灌注發(fā)生時，大量氧分子與黃嘌呤氧化酶接觸，形成大量ROS[16-17]。ROS 的降低可以有效保護心肌缺血再灌注損傷[18]，在本研究中，Irisin 在缺氧復氧的心肌細胞內可顯著提高細胞活力，降低ROS 的生成。ATP 作為人體重要的能量物質，也作為心肌收縮的功能的必需品，而超過95%是在線粒體中合成。線粒體合成的ATP 通過線粒體膜上的ADP/ATP 轉運體進入細胞質為機體供應能量。線粒體則通過氧化呼吸鏈將化學能轉化為電勢能儲存在線粒體內。在缺血再灌注損傷過程中，線粒體內電解質紊亂，氧化呼吸鏈關鍵酶失活，ROS 產生增加，線粒體膜電位顯著降低。而加入Irisin后，線粒體的氧化呼吸功能得到保護，表現(xiàn)在JC-1 水平較單純缺氧復氧處理的心肌細胞顯著提高，說明Irisin 對心肌細胞缺氧復氧的保護作用與線粒體膜電位密切相關。

另一方面，凋亡作為心肌損傷中的重要機制，也作為線粒體損傷的重要環(huán)節(jié)[19-21]。本研究也檢測了凋亡的一些相關指標，caspase-9 作為引起凋亡發(fā)生的重要分子，caspase-3 是細胞凋亡通路中的關鍵分子，兩個分子充分反映細胞凋亡通路的激活情況[22]。本研究中缺氧復氧引起心肌細胞caspase3 和caspase-9 基因的激活均可被Irisin 有效抑制。這些結果顯示Irisin對缺氧復氧心肌細胞的保護作用與凋亡有關。

綜上所述，Irisin 可顯著改善缺氧復氧后心肌細胞的細胞活力、減少ROS 生成、恢復線粒體膜電位、抑制凋亡通路，同時這也提示Irisin 對心肌細胞的保護作用與線粒體膜電位和凋亡相關。本研究可為臨床預防和治療心肌缺血再灌注損傷提供理論依據(jù)。