川楝子提取物中川楝素在大鼠體內的藥代動力學研究

于嬌妍 王慶偉 石 磊 趙 軍 張瑞濤 張 旸 徐 媛

空軍軍醫大學第二附屬醫院藥劑科，陜西西安 710038

川楝子是楝科Meliaceae 植物川楝Melia toosen-dan 的干燥成熟果實（又名金鈴子等）[1-3]，一般用作理氣、驅蟲藥，以四川產為道地藥材，因此叫做川楝子[4-6]。研究表明，川楝子有鎮痛、抗炎、抗菌、抗病毒、抑制呼吸中樞等作用，川楝子中四環三萜類化合物川楝素為其主要成分，是迄今為止發現的唯一抗肉毒毒素的天然化合物，能夠抑制多種腫瘤細胞生長，或誘導其調亡[7-13]。早期的研究主要集中于川楝素及川楝子不同提取部位的研究。目前對川楝子研究顯示川楝素可能是其主要的藥效和毒性成分[12,14-17]。

中藥藥代動學是近年發展非常迅速的學科，它在借鑒化學藥物藥動學方法和原理（如血藥濃度法）的基礎上，根據中藥“整體觀、系統觀”的特點發展了生物效應藥動學方法以間接推算藥動學參數[17-20]，因此本研究通過對川楝子中川楝素血藥濃度的測定來研究川楝子在大鼠體內的藥代動力學特點，進一步闡明川楝子的藥理作用。

1 對象與方法

1.1 實驗儀器

高效液相色譜（島津LC-30）和質譜儀（API 4000，AB）；TGL-20MV 離心機（湖南郝西公司）；電子分析天平（CP225D，Sartorius，十萬分之一）；UMV-1 多管渦旋混合器（優晟聯合科技有限公司）；超純水機（Milli-QAdvantageA10，Milipore）。

1.2 實驗試劑

川楝子中藥材（西安飲片廠）；川楝子醇提物（3.57 g 生藥/mL）；川楝素對照品（上海源葉生物，批號：Z11N7B24613，純度＞98%）；對乙酰氨基酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100018-200408）；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

清潔級健康雄性SD 大鼠，8～12 周，體重為250 g，購買于第四軍醫大學實驗動物中心[合格證號：SCXK（軍）2007-007]，通過動物倫理學審核，飼養條件：室溫（25±2）℃，相對濕度為（50±10）%，每天交替12 h 光照，自由飲水。

1.4 溶液的配置

1.4.1 川楝素儲備液及工作液的制備 精密稱取川楝素對照品3.06 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，即得306 μg/mL 的儲備液；取川楝素儲備液適量，甲醇稀釋成濃度為10.2、102.0、204.0、408.0、816.0、1224.0、1632.0、3060.0 ng/mL 系列工作液用于標準曲線樣品的制備，另取適量儲備液制備成濃度為30.6、1224.0、2040.0 ng/mL 的低、中、高質量濃度的質控樣品。

1.4.2 內標儲備液及工作液的制備 精密稱取對乙酰氨基酚對照品4.13 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，即得413 μg/mL 的對乙酰氨基酚儲備液。取內標儲備液適量，加甲醇稀釋成濃度為2070 ng/mL 內標工作液。

1.5 檢測條件

色譜條件：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），柱溫25℃，流動相：乙腈-0.01%甲酸溶液（梯度洗脫，0～4 min：乙腈5%～55%；4～6.5 min：乙腈55%；6.5～9 min：乙腈55%～5%），流速：0.6 mL/min，進樣體積：5 μL。質譜條件：掃描方式為多反應檢測掃描（MRM）；離子化方式為電噴霧離子源（ESI）；噴霧電壓：3500 V；毛細管溫度：350℃；負離子模式：川楝素：m/z573.3→m/z 531.3，碰撞能（CE）為-25 eV；去簇電壓（DP）為-116 eV，對乙酰氨基酚（內標）：m/z 150.1→m/z 107.0，CE：-27 eV，DP：-64 eV，見圖1。

圖1 LC-MS/MS 二級質譜圖

1.6 實驗分組及處理

1.6.1 實驗分組和樣品采集 取雄性SD 大鼠24 只，按體重隨機分為三組，每組8 只。給藥前12 h 禁食不禁水，分別按照15、30、60 g 生藥/kg（川楝素劑量為330、660、1320 μg/kg）灌胃大鼠川楝子提取物，給藥后0、0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h 眼 眶 靜脈叢取血0.25 mL，4℃，12 000 r/min 離心10 min 離心半徑5 cm，上清液（血漿樣品）-20℃儲存備用。

1.6.2 樣品處理方法 精密吸取血漿樣品100 μL，加入10 μL 內標液，2500 r/min 渦旋5 min 使混勻，再加入400 μL 甲醇，2500 r/min 渦旋5 min，靜置3 min，離心（12 000 r/min，4℃，10 min 離心半徑）取上清至1.5 mL EP 管中，減壓抽干，殘渣加100 μL 復溶液（50%乙腈-0.01%甲酸），2500 r/min 渦旋5 min 復溶，離心（12 000 r/min，4℃，10 min 離心半徑5 cm）取上清液，進LC-MS 測定。

2 結果

2.1 專屬性實驗

取空白血漿，加川楝素供試品，加內標和川楝素供試品，給藥后血漿加內標樣品，按“1.6.2”項下方法，處理樣品，進樣測定。空白血漿無干擾，川楝素為雙峰，依據藥典以雙峰之和計算。見圖2。

圖2 LC-MS/MS 色譜圖

2.2 線性關系考察

制備川楝素濃度分別為1.02、10.20、20.40、40.80、81.60、122.40、163.20、306.00 ng/mL的血漿樣品，加10 μL 內標液，處理后測定。測得的川楝素與內標峰面積的比值Y 對濃度（X）進行加權回歸（x-1）得回歸方程為Y=0.0185 x+0.0162（r=0.9953），川楝素血藥濃度在1.02～306 ng/mL 范圍內線性良好，最低定量限為1.02 ng/mL。

2.3 精密度與準確度

制備川楝素濃度為3.06、122.40、204.00 ng/mL 的血漿樣品各6 份，處理后連續進樣6 次，得日內精密度，連續進樣6 天，得日間精密度，精密度和準確度均符合要求。見表1。

表1 大鼠血漿中川楝素的精密度與準確度（，n=6）

表1 大鼠血漿中川楝素的精密度與準確度（，n=6）

2.4 提取回收率和基質效應

制備川楝素濃度為3.06、122.40、204.00 ng/mL 的血漿樣品各6 份，進樣分析，以加入量和測得量計算提取回收率。配制川楝素低、中、高濃度分別為3.06、122.40、204.00 ng/mL 的甲醇溶液各6 份；川楝素濃度為3.06、122.40、204.00 ng/mL 的血漿樣品各6 份，處理后測定。計算基質效應。見表2。

表2 大鼠血漿中川楝素的提取回收率與基質效應（%，，n=6）

表2 大鼠血漿中川楝素的提取回收率與基質效應（%，，n=6）

2.5 穩定性實驗

制備川楝素濃度為3.06、122.40、204.00 ng/mL 的血漿樣品各6 份，分別在25℃室溫放置24 h、4℃冰箱放置7 d、-20℃冰箱反復融凍3 次，處理后進樣。結果顯示血漿樣品穩定性良好。見表3。

2.6 藥代動力學實驗

按照“1.6”項下方法采集并處理血漿樣品，“1.5”項下液質條件進樣分析，采用DAS 2.0 軟件計算藥代動力學參數。與低劑量組、中劑量組比較，高劑量組Cmax和AUC（0～t）升高，CLz/F、Vz/F 降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。繪制濃度-時間曲線（C-T曲線），見圖3。

3 討論

實驗考察了不同方法提取大鼠血漿樣本中川楝素，因川楝素在有機溶劑中溶解度較高，因此比較了用乙酸乙酯萃取血漿中川楝素、乙腈和甲醇沉淀血漿蛋白的提取回收率，最后選擇提取回收率最高的甲醇沉淀法處理血漿樣品，并且經驗證該方法穩定可靠。實驗建立了LC-MS 法測定大鼠體內川楝素含量的方法，能夠將川楝素的色譜峰分離，能反映樣品的真實性，并且經驗證所建方法簡便、準確、靈敏。在計算的過程中，由于川楝素化學結構中存在醛-酮式結構的互變[21-24]，因此在色譜圖中出現雙峰，依據藥典以雙峰面積之和計算。

表3 不同存儲條件下含川楝素的血漿樣品穩定性（，n=6）

表3 不同存儲條件下含川楝素的血漿樣品穩定性（，n=6）

表4 灌胃3 種劑量川楝子提取物藥代動力學參數（，n=6）

表4 灌胃3 種劑量川楝子提取物藥代動力學參數（，n=6）

注：與低劑量組比較，*P＜0.05；與中劑量組比較，#P＜0.05。Cmax：最大血藥濃度；AUC：藥時曲線下面積；Tmax：達峰時；t1/2z：消除半衰期；MRT：平均滯留時間；CLz/F：清除；Vz/F：表觀分布容積

圖3 川楝素在大鼠體內的C-T 曲線（n=8）

川楝子不同給藥劑量的藥代動力學參數結果顯示低、中、高3 種劑量（15、30、60 g 生藥/kg）給藥后MRT（0～∞）沒有明顯變化，Cmax，AUC（0～t），以及CLz/F和Vz/F 差異均有統計學意義。隨給藥劑量的增大，AUC（0～t）與劑量比例不成正比，說明川楝素在大鼠體內為非線性動力學過程。中劑量組的AUC（0～t）是低劑量組的1.4 倍，高劑量組的AUC（0～t）明顯高于低、中劑量組，分別是中劑量組的4.4 倍，低劑量組的6.2 倍，說明大鼠給藥劑量超過30 g 生藥/kg 后，川楝素的生物利用度會大幅度提高，藥代動力學過程異常。15、30 g 生藥/kg 兩組間比較，隨給藥劑量CLz/F 增大1.4 倍，說明肝腎清除川楝素功能正常，但是60 g生藥/kg 給藥后CLz/F 清除率顯著降低，說明機體清除川楝素的能力降低，提示該劑量時肝腎代謝和排泄功能可能受損，機體內川楝素蓄積，與川楝子造成肝毒性有一定關系。因此，通過其改變川楝素在大鼠體內的藥代動力學過程能夠改善川楝子所致肝毒性。