三碘甲腺原氨酸對缺氧/復氧致乳小鼠心室肌細胞鈣離子通道異常的影響及其信號通路機制

劉 磊 曾 彬 廖小婷

武漢大學人民醫院心內科 武漢大學心血管病研究所 心血管病湖北省重點實驗室，湖北武漢 430060

三碘甲腺原氨酸（T3）是甲狀腺分泌的主要活性物質之一，T3已經證明可以改善心肌收縮功能，保護受損后心功能[1-2]。PI3K/Akt 信號通路參與心肌缺血再灌注損傷，且激活這一通道能減少缺血再灌注損傷，保護心肌[3]。T3可以激活Akt 信號通路從而發揮心臟保護作用，但T3對心肌細胞電生理的影響研究很少。本研究建立缺氧/復氧（H/R）模型，并用膜片鉗全細胞技術觀察T3對乳小鼠心室肌細胞L-型鈣離子通道電流（ICaL）的作用，旨在探討T3對心臟鈣離子通道的影響，并且驗證PI3K/Akt 信號通路是否在其中發揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 1～2 d 新生C57BL/6 小鼠20 只，雌雄不限，合格證號：SCXK（鄂）2015-0018，由湖北省實驗動物中心提供。

1.1.2 藥品和試劑 DMEM-F12 培養基（Hyclone 公司）；胎牛血清（Gibico 公司）；膠原酶Ⅱ、甲狀腺素T3、LY294002（Sigma 公司）；胰酶（Beyontime 公司）；兔抗鼠P-Akt、兔抗鼠P-PI3K（美國CST 公司）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（美國ASPEN 公司）；未注明者均為國產分析純。

1.1.3 溶液配制 記錄ICaL的細胞外液成分：氯化膽堿100 mmol/L，NaCl 35 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，MgCl21.0 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，NaH2PO40.33 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，BaCl20.1 mmol/L，4-氨基吡啶3 mmol/L，NaOH 調整pH 值到7.35。記錄ICaL電極內液成分：CsCl2120 mmol/L，CaCl21.0 mmol/L，Na2ATP 5 mmol/L，MgCl25 mmol/L，EGTA 11 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，CSOH 調整pH 值到7.2。

1.2 方法

1.2.1 心肌細胞培養 參照之前的方法[4]，取20 只1～2 d 小鼠，將心臟置于預冷PBS 液中清洗，留取心室并將心室肌組織剪碎，吸入含10 mL 的0.125%胰酶的離心管中4℃過夜。后用含0.035%膠原酶Ⅱ的消化液于37℃水浴振搖消化，待液體變混濁后停止消化，重復消化6～7 次直至消化完全。將收集的上清液1000 r/min 離心10 min，用含15%胎牛血清的完全培養液重懸細胞。接種于10 cm 培養皿中并置于培養箱（37℃、5%CO2）中差速貼壁1 h，將細胞懸液種于35 mm（1×106/mL）培養皿中培養。

1.2.2 心肌細胞H/R 模型的建立及實驗分組 細胞貼壁完全且搏動良好后，將培養液換為2 mL PBS 液，于缺氧培養箱（94%N2，5%CO2，1%O2，37℃）中培養4 h。隨后吸去PBS 液，更換為完全培養液并放入普通培養箱中培養24 h，即完成H/R 過程。本實驗分為五組：正常對照（Control）組、H/R 組、T3+H/R 組、T3+H/R+LY 組、H/R+LY 組。T3（20 ng/mL）在H/R 前24 h 加入培養液中；LY294002（LY）為PI3K/Akt 通路阻滯劑[5]，在細胞H/R 前24 h 以10 μmol/L 加入培養液中。

1.2.3 ICaL的記錄 應用全細胞膜片鉗技術記錄細胞鈣離子通道電流，微電極充灌電極內液后電阻在5～7 MΩ。室溫下，將細胞放入細胞槽內，用電極外液以2～3 mL/min 的流速進行灌流。選用大小相近、細胞狀態良好的細胞進行實驗。待高阻封接形成后，負壓脈沖破膜，補償膜電容、串聯電阻及漏電流，形成全細胞記錄方式，平衡5 min，待電極內液與細胞內液交換充分后，進行膜電流記錄。膜電流的大小以電流密度，即pA/pF 表示。

1.2.4 Western blot 測定PI3K/Akt 通路的蛋白表達 在培養皿中加入裂解液進行蛋白提純，采用BCA 法進行蛋白定量，SDS-PAGE 電泳，轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后用兔抗鼠P-Akt、兔抗鼠P-PI3K 抗體4℃孵育過夜。次日用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，化學發光法（ECL）顯影。采用凝膠成像系統（美國UVP 公司）進行分析，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin 條帶灰度值的比值反映P-Akt 和P-PI3K 的表達。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 T3對乳鼠心肌細胞H/R 損傷ICaL的影響

形成全細胞構型后，在電壓鉗模式下記錄電流。鉗制電位固定于-40 mV，指令電壓從-50 mV 以10 mV為步階逐步階躍至+60 mV。各組電流-電壓（I-V）曲線形狀近似。與Control 組比較，H/R 組ICaL峰值電流減?。≒ ＜0.01），I-V 曲線上移；與H/R 組比較，T3+H/R 組ICaL峰值電流增大（P ＜0.01），T3能部分恢復H/R損傷引起的I-V 曲線上移，且T3+H/R 組I-V 曲線左移，峰值電位從+10 mV 減小至-10 mV；與H/R 組比較，H/R+LY 組ICaL峰值電流減小（P ＜0.01）；與T3+H/R 組比較，T3+H/R+LY 組ICaL峰值電流減小（P ＜0.01）。見圖1。

2.2 T3對H/R 乳鼠心室肌細胞ICaL穩態失活曲線及穩態激活曲線的影響

采用雙脈沖實驗方法測定失活曲線，鉗制電壓-40 mV，將保持電位維持在-50 mV，從-50 mV 增加到60 mV（躍階10 mV），記錄內向峰電流，然后給測試電位0 mV，持續300 ms。以電流的相對值（I/Imax）對條件脈沖電壓作圖，得出ICaL穩態失活曲線（圖2a）。依Boltzman 方程I/Imax=1/[1+exp（V-V1/2）/K]進行擬合。式中Imax為最大膜電流，V1/2為半數失活電壓，K 為斜率參數。結果顯示，與Control 組比較，H/R 組V1/2減小[（-16.10±4.03）mV 比（-25.32±1.48）mV，P <0.05]，失活曲線右移，失活減慢。與H/R 組比較，T3+H/R組[（-24.49±1.58）mV]的V1/2增大（P <0.05），失活曲線左移，失活加快。各組K 值差異無統計學意義（P >0.05）。

將ICaL的I-V 曲線的結果轉化為膜電導（G），對條件刺激電壓作圖，采用Boltzman 方程G/Gmax=1/[1+exp（V-V1/2）/K]進行擬合，得到ICaL穩態激活曲線（圖2b）。Gmax為最大膜電導，V1/2為半數激活電壓，K 為斜率參數。結果顯示，與Control 組比較，H/R 組V1/2升高[（-24.20±0.35）mV 比（-10.04±0.33）mV，P <0.05]，激活曲線左移，激活加快；與H/R 組比較，T3+H/R 組[（-16.39±0.53）mV]的V1/2減?。≒<0.05），激活曲線右移，激活減慢。各組K 值差異無統計學意義（P>0.05）。

圖2 各組乳小鼠心室肌細胞L-鈣離子通道穩態失活曲線及穩態激活曲線

2.3 PI3K/Akt 信號通路在T3對心肌細胞H/R 損傷中的作用

與Control 組比較，H/R 組心肌細胞P-PI3K 及P-Akt 表達減少（P <0.01）；與H/R 組比較，T3+H/R組心肌細胞P-PI3K 及P-Akt 表達增加（P ＜0.01），H/R+LY 組心肌細胞P-PI3K 及P-Akt 表達減少（P ＜0.01）；與T3+H/R 組比較，T3+H/R+LY 組心肌細胞P-PI3K及P-Akt 表達減少（P ＜0.01）。見圖3。

圖3 Western blot 檢測H/R 模型和T3對PI3K/Akt 信號通路表達的影響

3 討論

鈣離子作為第二信使，在細胞病理和生理過程中起著重要作用，心肌細胞鈣離子的轉運調節心肌收縮與舒張。本實驗利用全細胞膜片鉗技術，證實H/R可顯著降低ICaL。很多文獻已經報道T3對心血管的保護作用[1-2]，本實驗發現T3可以有效抑制H/R 誘導的鈣離子通道損傷，保護心肌細胞L-型鈣離子通道，且保護作用可通過激活PI3K/Akt 信號通路來實現。

急性心肌梗死后容易并發缺血再灌注損傷，后者可以誘發一系列病理過程，如線粒體膜電位的損傷，細胞內鈣超載，氧化應激產物的形成等，這些會誘導心律失常、微循環障礙的發生，甚至最終造成嚴重的心力衰竭[6-7]。有研究表明，胞漿鈣離子的釋放不僅通過心肌肌漿網Ca2+-ATP 酶2a（SERCA2a），也通過Na+-Ca2+交換[8-9]。缺血再灌注損傷可導致Na+-Ca2+交換增加有關并誘導細胞內鈣超載[6]。研究顯示，缺血再灌注損傷時心肌細胞動作電位時程縮短，導致心肌細胞動作電位的不均一性，誘發折返性心律失常[10]。本實驗利用膜片鉗技術記錄H/R 損傷后的細胞鈣離子，發現L-型鈣離子通道受到抑制，峰值電流較正常心肌細胞明顯下降，I-V 曲線上移，與之前的研究一致[10-12]。

甲狀腺激素可以調節心肌收縮蛋白及鈣處理蛋白的表達，調節心肌細胞離子通道及交感神經興奮系統在心血管系統中的表達[13]。既往有研究顯示，急性心肌梗死常伴隨著體內甲狀腺激素水平的改變[13-14]，大量報道也證實，急性心肌梗死后運用低劑量T3可以促進心功能恢復并減輕心室重塑[1-2]，T3可以激活Akt并保護心功能[15-18]。本實驗通過T3預處理證實T3可以減輕H/R 對ICaL的抑制，恢復部分上移的I-V 曲線，恢復左移的激活曲線，使激活減慢，恢復右移的失活曲線，使失活加快。PI3K/Akt 是細胞的重要信號通路，在調節細胞凋亡、細胞增殖、自噬、分化等方面均發揮重要作用[3，19]，激活這一通道能保護心肌并減少缺血再灌注引起的損傷[3]。在本實驗中，H/R 損傷可減少PI3K/Akt 信號通路的激活，而T3預處理可顯著增加P-PI3K 和P-Akt 的表達。當加入PI3K/Akt 特異性通道阻滯劑后，T3對ICaL的作用被明顯抑制，證明T3通過激活PI3K/Akt 信號通路發揮作用。有研究顯示，Akt 的激活可以增加ICaL[20]，本實驗通過抑制PI3K/Akt 信號通路發現T3對L-型鈣離子通道的作用可能是由PI3K/Akt 信號通路來發揮的。

綜上，H/R 損傷導致心肌細胞ICaL下降，T3可以保護L-型鈣離子通道，減少通道電流的下降，其可能是通過PI3K/Akt 信號通路來發揮作用的。