CD44V4 和nm23 在三陰性乳腺癌中的表達及其相關性

李 俊 李春英

1.廣西壯族自治區柳州市柳鐵中心醫院甲乳疝外科，廣西柳州 545007；2.廣西壯族自治區柳州市柳鐵中心醫院病理科，廣西柳州 545007

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、表皮生長因子受體（Her-2）陰性的狀態，在乳腺癌各分子分型中占15%～20%[1]。TNBC 有很強的異質性，其遠處復發率和死亡率高于其他各型，但在治療上卻缺乏有效的手段，因而尋找新的靶向標志物以指導最佳治療一直是TNBC 研究的焦點[2]。CD44V4 是細胞黏附分子CD44變異型V 家族中的一員，參與細胞-細胞、細胞-胞外基質之間的特異性黏附，目前發現與多種惡性腫瘤的浸潤、轉移有關[3-4]。nm23 是轉移抑制基因，在細胞增殖、分化、癌變和腫瘤轉移中起重要作用，其下調與許多癌癥預后不良有關[5]，其在乳腺癌中的表達也是判斷淋巴結轉移的重要因素[6]。本課題前期的研究已發現CD44V4 同乳腺浸潤性導管癌不良臨床病理指標有關，但兩者在TNBC 中的表達情況及與臨床病理特征的相關性研究均少見報道。本研究探討CD44V4和nm23 在TNBC 中的表達及在腫瘤侵襲性生物學行為中的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010 年1 月～2015 年3 月廣西壯族自治區柳州市柳鐵中心醫院（以下簡稱“我院”）收治的浸潤性乳腺癌140 例為研究對象，其中TNBC 患者70 例設為研究組，非TNBC 患者70 例設為對照組。納入標準：①病理確診浸潤性乳腺癌，ER、PR、Her-2 檢測結果判定及分子分型參照指南標準[7]；②年齡18～73 歲；③術前未進行新輔助治療，術后根據免疫組化結果接受輔助治療；④臨床病理資料完整且患者知情同意。排除標準：①術前合并其他惡性腫瘤；②術前存在遠處轉移。入選患者均為女性，研究組年齡29～68 歲，中位年齡49.5 歲；對照組年齡32～73 歲，中位年齡54 歲。病理組織學分級采用Scarff-Bloom-Richardson 分級法分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ級。兩組患者年齡、月經狀況、病理組織學分級及臨床分期等基本資料比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會審批通過。

1.2 免疫組化檢測方法

應用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法檢測CD44V4 和nm23，第一抗體CD44V4和nm23 的SP 試劑盒（KIT-5001 批號：AD06017896，KIT-9710 批號：180711139a）均由福州邁新生物技術有限公司提供，所有操作依據試劑盒說明書進行。陽性對照為已知陽性切片，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.3 陽性結果判定標準

從每例標本石蠟切片中隨機取5 張進行免疫組化染色，在顯微鏡下隨機選取不重疊的10 個高倍視野陽性細胞進行計數，2 人雙盲觀測。CD44V4 陽性表達為胞膜或胞質棕黃色均勻染色或呈顆粒狀。結果判定根據陽性細胞數量和染色強度綜合判斷[8]，按陽性細胞占總細胞數的百分比評分：陽性細胞數≤5%為0 分，>5%～25%為1 分，>25%～75%為2 分，＞75%為3 分；染色強度評分：0 分為無著色，1 分為淺黃色，2 分為黃色，3 分為棕黃色；取兩項評分乘積作為總積分，≤1分為陰性，＞1 分為陽性。nm23 陽性表達為胞漿中棕黃色顆粒，結果判定按照綜合染色強度和細胞數進行[9]，染色強度評分與CD44V4 一致；陽性細胞數＜10%為0分；10%～50%為1 分；>50%～75%為2 分；＞75%為3分。兩項相加后0～1 分為陰性，≥2 分為陽性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件對所得數據進行分析，計數資料采用百分率表示，采用χ2檢驗，分析兩變量間的相關性采用Spearman 秩相關分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD44V4 和nm23 在TNBC 和非TNBC 中的表達情況

研究組70 例癌組織中，CD44V4 陽性表達率明顯高于對照組，nm23 的陽性表達率明顯低于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 CD44V4 和nm23 在TNBC和非TNBC中的表達情況[例（%）]

2.2 TNBC 患者CD44V4 和nm23 陽性表達與臨床病理參數的關系

TNBC 癌組織中CD44V4 陽性表達與脈管浸潤及淋巴結轉移有關（P ＜0.05），與患者年齡、原發瘤大小、TNM 分期、病理組織學分級無關（P ＞0.05）；nm23陽性表達與淋巴結轉移有關（P ＜0.05），與其他病理參數無明顯相關性（P ＞0.05）。見表2。

2.3 CD44V4 與nm23 表達的相關性

秩相關性檢驗顯示CD44V4 和nm23 之間無明顯相關性（rs=-0.166，P ＞0.05）。

3 討論

腫瘤轉移是乳腺癌患者死亡的主要原因[10]。轉移的發生需要腫瘤細胞成功地完成轉移級聯的每一步，包括從原發腫瘤脫離、向局部組織遷移和侵襲、在循環和淋巴系統中存活，最終在人體的遠處器官上定植。TNBC 是乳腺癌分子分型中預后最差的一型，由不同基因表達譜組成，雖然各亞組間預后存在較大差異，但其無病生存和總體生存仍較差，是預后不良的獨立危險因素[11-12]。為此，研究者們都在嘗試尋找新的預后生物標志物，用以鑒別預后更差的TNBC 患者，并作為臨床治療的靶點。

表2 TNBC 患者臨床病理參數與CD44V4 和nm23 陽性表達的關系[例（%）]

本研究對CD44V4 在TNBC 和非TNBC 中的表達進行免疫組化檢測，結果顯示：CD44V4 在TNBC 中陽性表達明顯高于非TNBC，且其在TNBC 中的表達與脈管浸潤、淋巴結轉移相關。這說明CD44V4 可能參與了TNBC 的惡性進展，增強了腫瘤細胞的侵襲性。CD44V4 是細胞黏附因子CD44 變異體的一員，是參與惡性腫瘤轉移的重要因子[3-4,13]，在乳腺癌的復發轉移中也起著重要作用[14]。基礎研究證實，腫瘤浸潤轉移的一個關鍵步驟就是脫落的腫瘤細胞穿過血管內皮進而遷移，在這個過程中，內皮細胞E-選擇素起著舉足輕重的作用[15]，而CD44V4 則是介導乳腺癌細胞跨內皮轉移的一個主要的E-選擇素配體[16]。乳腺癌脫落細胞上的E-選擇素配體CD44V4 與血管內皮細胞上表達的E 選擇素結合，介導黏附過程[14]，促進了腫瘤細胞脫離原發灶向遠處的轉移過程。

本研究對TNBC 和非TNBC 中nm23 蛋白表達進行檢測，發現其在TNBC 組中的陽性表達率明顯低于非TNBC 組，在TNBC 無淋巴結轉移者陽性表達率及表達強度明顯高于腋窩淋巴結轉移者，差異有統計學意義（P ＜0.05）。這與Iqbal 等[17]的基礎研究和Han等[6]的循證分析結果一致，說明nm23 基因的表達與乳腺癌高轉移潛能呈相關性，其下調可觸發腫瘤轉移進程。nm23 家族是腫瘤轉移抑制基因，目前認為其主要通過3 個方面調控腫瘤的侵襲轉移：①通過與多種基因相互作用調控腫瘤侵襲轉移過程；②參與信號傳導通路的改變調控腫瘤轉移；③通過影響細胞遷徙運動而調控腫瘤轉移[18-20]。雖然有學者認為nm23 編碼的部分蛋白在某些腫瘤中具有促進轉移的作用[17]，但與乳腺癌侵襲轉移相關的觀點卻是一致的。

在腋窩淋巴結轉移這一病理參數研究中，本研究對CD44V4 過表達和nm23 低表達是否有關聯進行了相關性檢測，以期待其聯合檢測能否增加對預后的判斷，但相關性分析顯示兩者表達無明顯相關性。原因可能為：①CD44V4 介導乳腺癌轉移是通過選擇素家族血管內皮E 選擇素實現，而nm23 對轉移的調控是與其他種類的黏附因子聯合完成，兩者之間確實沒有相關性；②選取的TNBC 患者未按基因表型進一步分亞型研究，使結果出現偏差，未能找到兩者的關聯。因此本研究的實驗分析并不能完全認定CD44V4 與nm23無關聯性，還需要做更多的深入研究。

綜上所述，檢測CD44V4 和nm23 在TNBC 中的表達及侵襲轉移中的關系有重要價值，可能成為判斷TNBC 預后的新生物標志物。