血紅素加氧酶1在兒童繼發性噬血細胞綜合征診斷及預后判斷中的價值研究

王穎超，李壯壯，朱桂英，殷楚云，王龍

噬血細胞綜合征（hemophagocytic syndrome，HPS），其特征是網狀內皮系統中的巨噬細胞活化引起的吞噬細胞現象，導致全血細胞減少、發熱、肝脾大等臨床表現，病情嚴重且威脅患兒生命［1］，而臨床上缺乏診斷該病的特異性指標。血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）是一種由各種刺激產生的溶血酶，在調節單核細胞/巨噬細胞的炎性反應方面起著關鍵作用［2］。HO-1主要分布于循環中的單核細胞及器官中的巨噬細胞（如肝臟枯否細胞、脾巨噬細胞），在多種應激狀態下，才會誘導血清中HO-1的高表達。本研究分別采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法及實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time PCR）檢測繼發性HPS、感染及健康兒童的血清HO-1、HO-1 mRNA表達水平及在HPS發展過程中的變化，采用受試者工作特征（ROC）曲線分析血清HO-1、鐵蛋白的HPS臨床診斷價值，旨在探討血清HO-1水平在繼發性HPS患兒的作用及臨床診斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年9月—2017年9月鄭州大學第一附屬醫院兒科病房收治的86例繼發性HPS患兒（HPS組）及排除HPS診斷的66例感染患兒（感染組），以同期門診體檢的79例健康兒童為對照組。繼發性HPS診斷標準：滿足噬血細胞性淋巴組織細胞增多癥（HLH）-2004診療指南診斷標準［3］；排除原發性HPS、固有免疫缺陷病、惡性腫瘤、其他血液系統疾病及激素使用者。感染組包括膿毒癥、肺炎、傳染性單核細胞增多癥等感染性疾病，且分別符合膿毒癥［4］、肺炎［5］、傳染性單核細胞增多癥［6］的診斷標準，感染組患兒均排除HPS診斷。本研究方案獲得鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準，研究對象法定監護人均簽署知情同意書。

本研究背景或創新點：

（1）噬血細胞綜合征（HPS）是可累及多個器官的巨噬細胞活化增殖性疾病，臨床表現復雜多變，且缺乏較為特異性的實驗室指標，病情進展迅速，易危及生命。血紅素加氧酶1（HO-1）是一種可被多種刺激誘導的血紅素降解酶，在單核/巨噬細胞炎性反應的調節中發揮關鍵作用。國外學者發現，HPS患者的HO-1水平明顯高于風濕性疾病、肝病、其他血液病、反復輸血患者和健康者，與血清鐵蛋白密切相關，具有很好的特異性。但未能進一步判斷HO-1對HPS最佳診斷閾值。（2）本研究進一步研究發現HPS患兒HO-1表達水平明顯高于其他如肺炎、膿毒癥、傳染性單核細胞增多癥等感染性疾病患者；并得出對HPS最佳診斷閾值，分析與血清鐵蛋白的相關性，以及聯合檢測血清HO-1與鐵蛋白對疾病的診斷更具有特異性及參考價值。結論：HO-1不僅可能成為一種新的HPS診斷和監測疾病活動性的標志物，而且影響患兒的預后。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 收集受試者性別、年齡、病因、實驗室檢查〔白細胞計數（WBC）、血紅蛋白（Hb）、血小板計數（PLT）、C反應蛋白（CRP）、乳酸脫氫酶（LDH）、自然殺傷（NK）細胞百分比、鐵蛋白、纖維蛋白原（FIB）〕資料。

1.2.2 ELISA法檢測血清HO-1水平 采集HPS組、感染組與對照組就診當日空腹外周血3 ml及HPS組患兒治療前、治療后2周、4周、8周空腹外周血3 ml，以3 400 r/min 離心8 min，留取血清，-80 ℃冰箱保存。ELISA試劑盒由美國MN公司提供，酶標儀由賽默飛世爾（上海）儀器有限公司提供，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 Real-time PCR檢 測HO-1 mRNA表 達 水 平 采集HPS組、感染組與對照組就診當日空腹外周血3 ml，采用淋巴細胞分離液收集單核細胞，使用Trizol試劑盒提取總RNA，參照MMLV反轉錄酶說明制備cDNA，HO-1 mRNA上游引物序列為：5'-CAGGCAGAGGGTGATAGAAGAGG-3'，下游引物序列為：5'-CTGGGAGCGGGTGTTGAGTG-3'；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參對照，上游引物序列為：5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3'，下游引物序列為：5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'。PCR反應條件：95.0 ℃預變性1 min后進入40個循環（95.0 ℃ 變性15 s；55.0 ℃退火15 s；72.0 ℃延伸45 s）。瓊脂糖凝膠電泳，計算機對電泳條帶進行掃描分析（Gel Works分 析），HO-1 mRNA相 對 表 達 量=（HO-1 mRNA吸光度/內參GAPDH吸光度）×100。

1.3 HPS患兒治療方法 86例繼發性HPS患兒，部分因放棄或未進行正規化療，52例患兒進行正規化療。患兒按照HLH-2004指南［3］化療，包括初始治療和維持治療，總療程40周。

1.4 預后判斷 86例患兒從確診開始隨訪，包括電話或門診隨訪，時間為1年。根據預后分為生存和死亡。

1.5 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行統計學分析。計量資料符合正態分布以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計量資料不符合正態分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用非參數檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman秩相關分析；血清HO-1和鐵蛋白水平對HPS的診斷價值采用ROC曲線分析，計算靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、ROC曲線下面積（AUC），AUC比較采用Z檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 HPS組中，男47例，女39例；年齡7個月～14歲，中位年齡4.2歲；均無家族遺傳史；感染相關HPS（IAHS）55例〔IAHS中EB病毒感染相關HPS（EBV-HLH）28例〕，腫瘤相關HPS（MAHS）15例，風濕免疫性疾病相關HPS（AAHS）9例，獲得性免疫缺陷病相關HPS 4例，病因不明3例。感染組中，男37例，女29例；年齡1～14歲，中位年齡4.5歲；肺炎42例，膿毒癥20例，傳染性單核細胞增多癥4例。對照組中，男48例，女31例；年齡1歲2個月～12歲，中位年齡6.6歲。HPS組患兒WBC、Hb、PLT、NK細胞百分比、FIB水平低于感染組，CRP、LDH、鐵蛋白水平高于感染組，差異均有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 HPS組與感染組患兒實驗室指標比較Table 1 Comparison of laboratory indices between HPS group and infection group

2.2 三組間血清HO-1、HO-1 mRNA表達水平比較 對照組、感染組、HPS組血清HO-1、HO-1 mRNA表達水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；其中感染組、HPS組血清HO-1、HO-1 mRNA表達水平高于對照組，HPS組血清HO-1、HO-1 mRNA表達水平高于感染組，差異均有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

表2 三組間血清HO-1、HO-1 mRNA表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum HO-1 and HO-1 mRNA expression levels among the three groups

表2 三組間血清HO-1、HO-1 mRNA表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum HO-1 and HO-1 mRNA expression levels among the three groups

注：HO-1=血紅素加氧酶1；與對照組比較，aP＜0.05；與感染組比較，bP＜0.05

組別 例數 HO-1（μg/L） HO-1 mRNA對照組 79 2.98±0.90 3.25±1.23感染組 66 11.32±3.46a 15.37±3.28a HPS組 86 31.44±7.20ab 29.78±6.92ab F值 322.612 268.128 P值 〈0.001 〈0.001

2.3 HPS患兒治療前后血清HO-1水平比較 HPS患兒治療前、治療后2周、4周、8周血清HO-1水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中治療后2周、4周、8周血清HO-1水平低于治療前，治療后4周、8周血清HO-1水平低于治療后2周，治療后8周血清HO-1水平低于治療后4周，差異均有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

表3 HPS患兒治療前后血清HO-1水平比較（±s，μg/L，n=52）Table 3 Comparison of serum HO-1 level in children with HPS before and after treatment

表3 HPS患兒治療前后血清HO-1水平比較（±s，μg/L，n=52）Table 3 Comparison of serum HO-1 level in children with HPS before and after treatment

注：與治療前比較，aP＜0.05；與治療后2周比較，bP＜0.05；與治療后4周比較，cP＜0.05

時間 HO-1治療前 31.56±6.94治療后2周 18.13±4.23a治療后4周 11.37±2.42ab治療后8周 7.54±1.72abc F值 81.812 P值 〈0.001

2.4 HPS患兒血清HO-1水平與臨床指標的相關性分析 HPS患兒血清HO-1水平與WBC、Hb、PLT、LDH、NK細胞百分比、FIB均無直線相關關系（rs=-0.153，P=0.334；rs=-0.213，P=0.172；rs=0.202，P=0.238；rs=0.146，P=0.355；rs=0.176，P=0.266；rs=0.092，P=0.532），與CRP、鐵 蛋 白 呈 正 相 關（rs=0.390，P=0.003；rs=0.661，P＜0.001）。

2.5 血清HO-1和鐵蛋白水平對HPS的診斷價值 血清HO-1水平選取最佳節點18.23 μg/L時，其診斷HPS的靈敏度為82.0%，特異度為99.1%，陽性預測值為98.9%，陰性預測值為84.6%，AUC=0.883；鐵蛋白水平選取最佳節點2 370 μg/L時，其診斷HPS的靈敏度為82.0%，特異度為72.0%，陽性預測值為74.5%，陰性預測值為80.0%，AUC=0.830。血清HO-1聯合鐵蛋白診斷HPS的AUC=0.958。血清HO-1診斷HPS的AUC大于鐵蛋白，差異有統計學意義（Z=1.68，P=0.046）；血清HO-1聯合鐵蛋白診斷HPS的AUC大于血清HO-1和鐵蛋白，差異均有統計學意義（Z=1.81，P=0.035；Z=1.98，P=0.023，見圖1）。

圖1 血清HO-1和鐵蛋白水平診斷HPS的ROC曲線Figure 1 ROC curves of serum HO-1，ferritin，and the combination of the two in the diagnosis of HPS

2.6 不同預后HPS患兒臨床資料比較 隨訪1年，86例HPS患兒中63例生存，23例死亡。生存與死亡HPS患兒性別、年齡、WBC、Hb、NK細胞百分比、FIB水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；生存與死亡HPS患兒病因分布比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；死亡HPS患兒CRP、LDH、鐵蛋白、HO-1水平較生存HPS患兒升高，PLT較生存HPS患兒降低，差異均有統計學意義（P＜0.05，見表4）。

表4 不同預后HPS患兒臨床資料比較Table 4 Comparison of clinical data of HPS patients with different outcomes

3 討論

HPS是一種危及生命的疾病，根據病因，可分為原發性和繼發性。原發性HPS主要是由于損害淋巴細胞毒性的遺傳缺陷引起［7］。繼發性HPS常由感染、腫瘤、免疫性疾病、藥物、移植等因素引起，也可能與免疫缺陷有關，而最常見的病因是感染［8-9］。LI等［10］研究發現，在HPS中，血清鐵蛋白水平升高比低纖維蛋白原血癥、高三酰甘油血癥和兩系血細胞減少癥更常見。高鐵蛋白血癥不僅存在于HPS中，也存在于其他風濕性疾病、肝臟疾病和頻繁輸血的血液疾病中［11］，缺乏特異性。所以，發現診斷HPS更為特異性的指標，對疾病的早期診斷、減少漏診及誤診率極其重要。

HO-1是一種誘導酶，能將血紅素降解為膽綠素、Fe2+和一氧化碳，在清除衰老和受損的紅細胞、全身鐵穩態、紅細胞生成、血管止血、氧化和炎性應激反應中發揮重要作用［12］。MIYAZAKI等［13］研究發現，HPS患者血清中HO-1水平明顯高于其他血液病如白血病、淋巴瘤等。KIRINO等［11］研究發現，在HPS和Still'S病（ASD）患者中，血清HO-1水平明顯高于其他風濕性、肝臟及血液系統疾病。王宇等［14］發現血清HO-1水平在獲得性HPS患者中明顯升高，尤其在自身免疫性疾病相關性HPS患者中明顯高于淋巴瘤相關性HPS及IAHS。提示血清HO-1水平有可能成為診斷HPS的一個更為特異性的指標。而國內外對于HO-1在HPS中的研究多是關于成年人，關于兒童HO-1的研究尚未見報道。

本研究顯示，HPS組患兒外周血HO-1、HO-1 mRNA表達水平明顯高于感染組和對照組，經治療后HPS組患兒血清HO-1水平明顯下降，維持在一個較低的水平內。與王宇等［14］研究相符。KIRINO等［11］研究也說明，在HPS和成年ASD活躍的患者中，血清HO-1水平升高，HO-1水平與疾病活動密切相關，而與臨床表型無關，而且在血清HO-1水平升高的HPS和ASD患者中，部分或者全部存在HO-1 mRNA過表達。本研究發現，當血清HO-1水平為18.23 μg/L，血清鐵蛋白為2 370 μg/L時，HPS可與感染明顯區分。血清鐵蛋白與HO-1診斷HPS的靈敏度均為82.0%，但血清鐵蛋白特異度為72.0%，血清HO-1特異度為99.1%。血清HO-1聯合鐵蛋白診斷HPS的AUC大于血清HO-1和鐵蛋白，說明血清HO-1在診斷HPS方面具有很好的臨床價值，而且聯合檢測血清鐵蛋白與HO-1更具有診斷意義。與國外研究結果一致，高水平的血清鐵蛋白被廣泛用作HPS的標志物［15］，但在診斷及預測預后方面并不特異，在肝損傷、多次輸血等情況下亦可有不同的表達水平［16］。而血清HO-1水平卻不受這些因素的影響，相比鐵蛋白，更具有特異性。

目前研究表明，HPS患者血清HO-1與鐵蛋白水平存在相關性，HO-1活性增加產生Fe2+，作為HO-1的亞鐵血紅素分解產物，是鐵蛋白合成的有力促進劑，另外，由于Nrf2調控HO-1和鐵蛋白基因的轉錄，轉錄因子的激活可能參與了這兩種分子的同時過量產生，而且似乎HO-1、Nrf2或兩者共同均參與了肝臟疾病和頻繁輸血患者血清鐵蛋白水平升高［11］。這很好地解釋了血清HO-1和鐵蛋白具有高度相關性的原因。本研究顯示，HPS患兒血清HO-1水平與鐵蛋白呈正相關，而與WBC、Hb、PLT、LDH、NK細胞百分比、FIB均無直線相關關系，更加驗證了這一關系。而HPS患者循環HO-1的來源尚不確定，需要進一步研究來確定血清HO-1水平升高的機制和來源。

本研究進一步分析顯示，死亡HPS患兒CRP、LDH、鐵蛋白、HO-1水平較生存HPS患兒升高，PLT較生存HPS患兒降低。生存與死亡HPS患兒病因分布比較有差異，病因多以IAHS、MAHS為主，觀察上述指標有助于判斷預后。

綜上所述，血清HO-1、HO-1 mRNA表達水平在繼發性HPS患兒中明顯升高，對HPS的診斷及預后判斷均具有明顯的參考價值，聯合檢測血清HO-1與鐵蛋白對診斷更具有特異性。不足之處是本研究為單中心觀察性的臨床研究，樣本量偏少，期待多中心、大樣本的隨機對照試驗，進一步確定HO-1和HO-1 mRNA在HPS診斷和治療方案制定中的意義。

作者貢獻：王穎超進行文章的構思與設計，撰寫論文，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監督管理；李壯壯進行研究的實施與可行性分析，數據收集；朱桂英進行數據整理，統計學處理；殷楚云進行結果的分析與解釋；王龍進行論文的修訂。

本文無利益沖突。