TGF-β通過(guò)Lnc-ATB促進(jìn)食管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究

魯之中，李軍民，胡云芝，李曉輝，李衛(wèi)，姜富國(guó)，李帥，劉學(xué)慶

（焦作市人民醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科，2.兒科，3.腫瘤外科，河南 焦作 454002；4.重慶醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，重慶 400016）

食管癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，對(duì)健康危害極大[1]。隨著醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)的發(fā)展，食管癌發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)的研究已成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）是一組新發(fā)現(xiàn)的可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及分化的TGF超家族，其在腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[2-3]。然而在食管癌細(xì)胞中TGF-β所發(fā)揮的作用及機(jī)制目前仍不完全清楚。本研究擬深入探討TGF-β在食管癌的功能及機(jī)制，為進(jìn)一步揭示食管癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

食管癌細(xì)胞系EC9706（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)），RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司），Lnc-ATB siRNA及對(duì)照（廣州銳博科技有限公司），Trizol裂解液（美國(guó)Sigma公司），TGF-β（深圳百恩維生物科技有限公司）；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen公司），Transwell小室（德國(guó)Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用含10% Gibco胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)食管癌細(xì)胞系EC9706，溫度為37℃，二氧化碳CO2濃度為5%，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至70%左右的融合度后，將5μl Lnc-ATB-siRNA及Lnc-ATB對(duì)照經(jīng)250μl LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)入EC9706細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)染后的EC9706細(xì)胞分為L(zhǎng)nc-ATB-siRNA組及Lnc-ATB-NC組。

1.2.2 Lnc-ATB表達(dá)水平檢測(cè)待食管癌細(xì)胞加入10 ng/ml TGF-β，將給予TGF-β處理的細(xì)胞作為T(mén)GF-β組，未給予TGF-β處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。48 h后，收集兩組細(xì)胞，用Trizol裂解細(xì)胞，分別提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，59℃退火35 s，共進(jìn)行39個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。Lnc-ATB正向引物 ：5’-TCTGGCTGAGGCTGGTTGAC-3’，反向引物 ：5’-ACACAGAATAAAATAACAC-3’；內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）正向引物：5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3’，反向引物：5’-GAGGTCAATGAAGGGGTCATTG-3’。

1.2.3 EC9706細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力檢測(cè)EC9706細(xì)胞不給予任何處理作為空白組；轉(zhuǎn)染Lnc-ATB-siRNA作為L(zhǎng)nc-ATB-siRNA組；給予10 ng/ml TGF-β處理并轉(zhuǎn)染Lnc-ATB-NC作為T(mén)GF-β+Lnc-ATB-NC組；給予10 ng/ml TGF-β處理并轉(zhuǎn)染Lnc-ATB-siRNA作為T(mén)GF-β+Lnc-ATB-siRNA組。48 h后用胰酶消化各組細(xì)胞，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗2遍，用含10%牛胎血清蛋白的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/ml，取兩組細(xì)胞懸液各150μl，加入已預(yù)先用Matrigel包被基底膜的Transwell小室。下室加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基600μl，培養(yǎng)48 h。而后取出小室，PBS沖洗2次，用棉簽小心擦去微孔膜內(nèi)層的細(xì)胞，95%乙醇固定兩組細(xì)胞5 min，用1%結(jié)晶紫溶液著色，PBS洗滌2次，倒置顯微鏡下分別計(jì)數(shù)，每個(gè)樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野。檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移步驟與細(xì)胞侵襲基本相同，區(qū)別在于細(xì)胞轉(zhuǎn)移Transwell小室預(yù)先不包被Matrigel基底膜。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β上調(diào)食管癌EC9706細(xì)胞中Lnc-ATB的表達(dá)

TGF-β處理食管癌EC9706細(xì)胞48 h后，分別提取TGF-β組和對(duì)照組細(xì)胞的總RNA，均逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用qRT-PCR檢測(cè)各組間Lnc-ATB的表達(dá)，TGF-β組Lnc-ATB的相對(duì)表達(dá)量為（1.000±0.062），對(duì)照組為（0.417±0.084），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.431，P=0.007），TGF-β組較對(duì)照組高。而后應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)Lnc-ATB siRNA在EC9706細(xì)胞中的干涉效果，結(jié)果顯示Lnc-ATB-siRNA組EC9706細(xì)胞中Lnc-ATB相對(duì)表達(dá)量為（0.438±0.073），Lnc-ATB-NC 組為（1.000±0.082），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.392，P=0.021），Lnc-ATB-siRNA組較Lnc-ATB-NC組低，Lnc-ATB siRNA可有效沉默EC9706細(xì)胞中Lnc-ATB的表達(dá)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組EC9706細(xì)胞中Lnc-ATB的相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

2.2 TGF-β組與對(duì)照組TGF-β處理后EC9706細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力比較

TGF-β處理食管癌EC9706細(xì)胞48 h后，TGF-β組侵襲細(xì)胞數(shù)為（98.328±11.033）個(gè)，對(duì)照組為（64.238±7.431）個(gè)，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.542，P=0.032）；TGF-β組轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)為（45.759±15.561）個(gè)，對(duì)照組為（27.752±13.453）個(gè)，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.142，P=0.023），TGF-β組侵襲和轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)均高于對(duì)照組，提示TGF-β可促進(jìn)EC9706細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。見(jiàn)圖2、3。

圖2 TGF-β組與對(duì)照組TGF-β處理后EC9706細(xì)胞的侵襲能力比較 （×200）

圖3 TGF-β組與對(duì)照組TGF-β處理后EC9706細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力比較 （×200）

2.3 各組TGF-β通過(guò)Lnc-ATB促進(jìn)EC9706細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力比較

空白組侵襲細(xì)胞數(shù)為（48.492±11.325）個(gè)，Lnc-ATB-siRNA組 為（22.328±8.925） 個(gè)，TGF-β+Lnc-ATB-NC組為（74.284±14.925） 個(gè)，TGF-β+Lnc-ATB-siRNA組為（37.827±5.329）個(gè)，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.324，P=0.014）；空白組轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)為（39.728±9.645）個(gè)，Lnc-ATB-siRNA組為（19.658±7.371）個(gè)，TGF-β+Lnc-ATB-NC組 為（51.462±3.627） 個(gè)，TGF-β+Lnc-ATB-siRNA組為（29.527±8.359）個(gè)，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.792，P=0.026）。TGF-β+Lnc-ATB-NC組細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力高于其他組（P＜0.05）；空白組細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力高于TGF-β+Lnc-ATB-siRNA組 與 Lnc-ATB-siRNA組（P＜0.05）；TGF-β+Lnc-ATB-siRNA組與Lnc-ATB-siRNA組細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖4～7。

圖4 各組TGF-β通過(guò)Lnc-ATB上調(diào)EC9706細(xì)胞侵襲能力 （×200）

圖5 各組TGF-β通過(guò)Lnc-ATB上調(diào)EC9706細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力 （×200）

圖6 各組TGF-β通過(guò)Lnc-ATB上調(diào)EC9706細(xì)胞侵襲能力比較 （±s）

圖7 各組TGF-β通過(guò)Lnc-ATB上調(diào)EC9706細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力比較 （±s）

3 討論

TGF-β作為生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖起關(guān)鍵調(diào)控作用，在多種癌癥發(fā)生、發(fā)展過(guò)程發(fā)揮重要作用[4]。既往有研究報(bào)道，TGF-β在食管癌中異常高表達(dá)，其表達(dá)與食管癌的分期、分級(jí)密切相關(guān)，腫瘤分化程度越低，TGF-β的表達(dá)越強(qiáng)[5]。更有研究顯示，食管癌中TGF-β下游效應(yīng)分子SMAD4表達(dá)水平降低，其表達(dá)與腫瘤的臨床病理分期及浸潤(rùn)深度呈負(fù)相關(guān)[6]。本研究同樣顯示，給予TGF-β后，食管癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)。由此可見(jiàn)，TGF-β在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。有大量報(bào)道試圖闡明TGF-β在腫瘤中的作用機(jī)制，比如PASCHE[7]認(rèn)為T(mén)GF-β由基質(zhì)及腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生后，在腫瘤微環(huán)境中可發(fā)揮腫瘤促進(jìn)因子的作用，通過(guò)刺激腫瘤新生血管的生成，發(fā)揮免疫抑制及合成細(xì)胞外基質(zhì)等作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲。但這些研究并不能為T(mén)GF-β在食管癌中的作用提供更精確的分子機(jī)制。

TGF-β是一個(gè)被廣泛研究的細(xì)胞因子，惡性腫瘤會(huì)釋放大量TGF-β幫助癌細(xì)胞快速分裂，同時(shí)借助Treg抑制免疫細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的殺傷力[8]。但是由于正常細(xì)胞不能缺少TGF-β，因此很難設(shè)計(jì)靶向的方法來(lái)治療癌癥。科學(xué)家需要進(jìn)一步探索TGF-β的分子機(jī)制，從其上下游作用的關(guān)鍵分子著手，研究相應(yīng)的治療靶點(diǎn)，這也是本研究的目的所在。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本，其＞200個(gè)核苷酸，不具有蛋白編碼潛能。許多研究表明，LncRNA經(jīng)常在各種疾病中失調(diào)，在廣泛的生物過(guò)程中有多種功能，如調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及遷移等[9-10]。有文獻(xiàn)報(bào)道，TGF-β可以激活部分長(zhǎng)鏈非編碼RNA的表達(dá)及功能[11-12]。YUAN等[13]利用LncRNA芯片，結(jié)合經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)了1個(gè)介導(dǎo)TGF-β促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的LncRNA，并將這個(gè)新LncRNA命名為L(zhǎng)nc-ATB。有研究發(fā)現(xiàn)，Lnc-ATB在肝細(xì)胞癌患者組織中表達(dá)水平異常升高，在肝細(xì)胞癌患者轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)則進(jìn)一步上調(diào)，其表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌的侵襲特征呈正相關(guān)，與肝細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后亦呈正相關(guān)[14]。本研究主要探討TGF-β在食管癌中是否通過(guò)激活Lnc-ATB參與腫瘤的進(jìn)展，結(jié)果顯示給予TGF-β后，食管癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，同時(shí)Lnc-ATB的表達(dá)升高，而沉默食管癌細(xì)胞中Lnc-ATB的表達(dá)，給予TGF-β后，細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力并未增強(qiáng)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明在食管癌中TGF-β通過(guò)上調(diào)Lnc-ATB的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。本研究為探索食管癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，為食管癌的治療提供了新的分子靶標(biāo)。