組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA對小鼠T淋巴瘤細胞EL4中miR-150表達及增殖的影響

肖剛峰 任富鵬

非特指型外周T細胞淋巴瘤是一組異質性很強的淋巴系統惡性疾病，是常見的非霍奇金淋巴瘤亞型。其治療進展緩慢，預后較差。非特指型外周T細胞淋巴瘤的發病機制迄今為止尚未得到完全闡明。miR-150作為腫瘤抑制miRNA在多種惡性腫瘤中發生異常表達，介導多種腫瘤的發生、發展及轉移[1]。近年來有研究發現miR-150在T細胞淋巴瘤低表達[2]，但其低表達的原因尚不清楚。最新研究資料揭示，表觀遺傳可調控microRNA表達，且乙酰化修飾是重要的表觀遺傳修飾方式之一[3-4]。我們推測表觀遺傳機制中的組蛋白去乙酰化酶的激活可能是抑制microRNA表達的原因，且研究亦發現組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitors，HDACi）作為新型抗腫瘤藥物在體內外均有抗腫瘤作用。辛二酰苯胺異羥肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）是第二代氧肟酸類HDACi，本研究探討HDACi SAHA對小鼠T淋巴瘤細胞EL4中miR-150表達的影響，以及對腫瘤細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料 小鼠淋巴瘤細胞（EL4）購于中國科學院上海細胞庫。二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍（MTT）購于美國SIGMA公司；1640培養液購于GIBCO公司。胎牛血清購于中國科學院生物工程研究所。SAHA購自美國Sigma-Aldrich公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司，TaqManMicroRNA Reverse Transcription Kit購自Applied Biosystems公司。miR-150引物、U6引物由Primer 5.0設計并購自上海百力格生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 用含10%胎牛血清的1640培養液培養 EL4細胞，條件為5%CO2，37℃。

1.2.2 SAHA處理EL4細胞 將5×105/ml EL4細胞接種于6孔板各孔中，細胞進行無血清同步化處理后加入0.25、0.5、1μmol/L SAHA 孵育 32h。將 SAHA 處理過的EL4細胞洗脫、離心，定量 RT-PCR法測定細胞中miR-150的表達水平。

1.2.3 定量RT-PCR測定細胞中miR-150的表達水平 收集細胞，用Trizol提取總RNA，分管光度計測定濃度。分別通過miR-150和U6特異性引物，利用Taq－ManMicroRNA Reverse Transcription Kit合成 cDNA，進行 qRT-PCR（ABIPRISM 7000 Sequence Detection System）。反應條件：95℃，10min；95℃，15s；60℃，60s；40 個循環；軟件分析其Ct值，以U6作為內參，由公式2-ΔCt計算miR-150在各組EL4細胞中的相對表達量。

1.2.4 MTT法測定細胞增殖能力 收集各組細胞，制成細胞懸液并計數。再將等量細胞接種到96孔培養板,每孔加 MTT（5g·L-1）10μl，培養 4h 后,吸棄上清液,再加入 DMSO（150μl），于微量振蕩器充分振蕩 10min,置酶標儀上于490nm處測吸光度（OD值）。各組細胞的增殖率（%）=實驗組平均OD值/對照組平均OD值×100%。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料采用表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組細胞miR-150相對表達量比較 見表1、圖1。

表1 4組細胞m i R-150相對表達量比較

圖1 4組細胞m i R-150相對表達量比較（與對照組比較，*P＜0.05）

由表1、圖1可見，在使用HDACi SAHA來處理EL4細胞后，EL4細胞中miR-150的表達增加（均P＜0.05），且隨著SAHA劑量的增加而增加。

2.2 4組細胞增殖情況比較 見表2、圖2。

表2 4組細胞增殖情況比較

圖2 4組細胞增殖情況比較（與對照組比較，*P＜0.05）

由表2、圖2可見，在使用HDACi SAHA來處理EL4細胞后，EL4細胞增殖能力下降（均P＜0.05）。

3 討論

非特指型外周T細胞淋巴瘤是一組異質性很強的T細胞惡性腫瘤，其確切的發病機制尚未闡明。積極探索本病的發病機制，不僅具有重要的理論意義，而且可能為本病的診斷與治療提供新的策略。miRNA是一類非蛋白編碼小分子RNA，根據其在T淋巴細胞分化以及B細胞淋巴瘤的研究成果[5-7]，可以推測miRNA在外周T細胞淋巴瘤發病中同樣發揮著重要的作用。miR-150是長度為22個核苷酸的單鏈小分子RNA，參與免疫系統和造血系統發生、胚胎發育以及干細胞分化的調節[8-10]。近年來研究發現，miR-150作為腫瘤抑制性microRNA參與包括外周T細胞淋巴瘤在內的多種惡性腫瘤的發生、發展[11-12]。在淋巴及造血系統惡性腫瘤中，其多為低表達。作為腫瘤抑制物，miR-150的低表達使得細胞分化凋亡異常，參與了惡性淋巴瘤的發生、發展。

HDACi是一類具有抗腫瘤活性的新型藥物，研究發現其在體內外均有抗腫瘤作用，目前已應用于皮膚T細胞淋巴瘤[13-14]。其抗腫瘤作用的分子機制尚不十分清楚，存在許多問題尚待進一步闡明。我們推測其可能通過恢復或提高關鍵腫瘤抑制因子如miR-150等表達來起作用。為此，我們使用HDACi SAHA來處理小鼠T淋巴瘤EL4細胞，發現EL4細胞miR-150的表達隨著SAHA劑量的增加而增加，表明miR-150的表達可能受到乙酰化修飾的調控，但具體機制有待進一步研究。比如可以通過分析組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）與組蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferases，HATs）的變化，同時結合阻斷策略來檢測miR-150的表達變化，間接驗證對miR-150的調控影響。其次，可以用免疫共沉淀技術等方法來直接驗證與miR-150的關系，以明確miR-150乙酰化修飾調控的具體機制。在本研究中，我們同時進一步對經HDACi SAHA處理后的EL4細胞增殖能力進行了觀察，發現經HDACi SAHA處理后，EL4細胞增殖能力下降，SAHA抗增殖能力呈劑量依賴可能。HDACi下調EL4細胞的增殖能力，我們推測其部分機制可能是通過恢復或提高miR-150的表達來實現。

綜上所述，本研究提示，SAHA作為HDACi能夠恢復或提高miR-150的表達并有效抑制小鼠T淋巴瘤細胞增殖。本實驗結果豐富了對HDACi作用機制的認識，為SAHA應用于非特指型外周T細胞淋巴瘤的臨床治療提供一定的理論依據。