(1,3)-β-D-葡聚糖在不同證據級別的侵襲性肺曲霉病中的表現

張鑫強,陳慧敏,劉素玲,凌 勇,葉 龍,趙 越,陳曉麗,周典蓉,李正康

(廣東省人民醫院 檢驗科，廣東省醫學科學院,廣東 廣州510080)

侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)是臨床常見的肺部感染性疾病,特別是在免疫力低下或者有嚴重基礎疾病的患者中常見,比如造血干細胞移植患者、固體器官移植患者、重大手術患者、艾滋患者以及其他免疫抑制治療的患者。這些患者往往缺乏典型的臨床表現,早期診斷的效果也不理想。一項多中心的研究報道[1],在危重癥患者中,根據歐洲癌癥研究和治療組織和美國真菌病研究組(EORTC/MSG)2008年修訂的侵襲性真菌分級標準[2],94例患者為確診(proven) 級別的侵襲性曲霉感染(占17%),該級別患者的病死率高達79%。德國一項前瞻性的多中心隊列研究顯示[3],發生IPA的血液病患者84天病死率為33.8%(49/145),歸因病死率為26.9%。來自臺灣的IPA病例分析報告也顯示,在2002-2012年間,407例IPA患者的整體病死率也達到30.22%[4]。IPA的致死率很高,因此,早期快速診斷曲霉具有重要的臨床價值。目前常用的診斷方法有半乳甘露聚糖(GM)、(1-3)-β-D- 葡聚糖(G實驗)、真菌培養、相關抗原抗體篩查和分子檢測,目前臨床常見的方法是前3種。一項比較G實驗和GM實驗的研究發現[5],在免疫抑制的機械通氣危重癥患者中,13例probable IPA患者的G實驗結果顯著高于無IPA患者(375 pg/mL VS.64 pg/mL,P<0.001),G實驗診斷probable IPA的靈敏度和特異度分別為88%和82%,血清GM實驗則分別為35%和70%,但肺泡灌洗液的GM實驗的靈敏度和特異度的結果分別為70%和94%。由于肺泡灌洗液是有創操作,臨床采樣較困難,因此無創的血清實驗正受到越來越多的重視。本研究根據真菌培養和病理檢查的結果,分析了G實驗在上述不同檢查結果中的表現,從而探索G實驗是否可輔助培養和病理檢查診斷IPA。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年1月-2017年12月在廣東省人民醫院診斷為侵襲性肺曲霉病的患者病例信息,收集患者以下信息：人口學資料、肺穿刺組織病理結果、呼吸道標本(痰、纖支鏡沖洗液、肺泡灌洗液)培養結果、(1,3)-β-D-葡聚糖結果。根據2008年EORTC/MSG共識組制定侵襲性真菌分級標準[2],分為3級：確診、擬診和疑診。確診需要組織病理學依據或者正常無菌部位標本曲霉培養陽性,擬診患者需符合1項宿主因素、1項臨床依據和1項微生物學標準。本研究納入的病例為確診和擬診患者,根據病理和培養的結果分為3組：病理+培養雙陽性組、單培養陽性組、單病理陽性組。

1.2 (1,3)-β-D-葡聚糖檢測

實驗試劑盒購自湛江安度斯生物有限公司,商品名為“真菌(1,3)-β-D-葡聚糖檢測試劑盒(光度法)”,嚴格按照產品說明書進行操作,檢測結果解釋：陰性：<100.5 pg/ml；灰區(需要連續監測)：100.5-151.5 pg/ml；陽性：>151.5 pg/ml。

1.3 呼吸道標本培養

臨床送檢的痰或者纖支鏡沖洗液均常規接種血平板、沙氏平板、麥康凱平板、含萬古霉素巧克力平板,置于5%CO2孵箱37℃培養24-48 h,對排除污染的曲霉菌轉接到馬鈴薯瓊脂平板,置于普通孵箱28℃培養48-72 h,進行采用乳酸石碳酸棉藍染液進行霉菌直接制片觀察,根據鏡下特征和培養特征進行霉菌的判定。

1.4 統計學分析

采用 IBM SPSS 22.0版本進行統計學分析。計量資料不滿足正態分布特征,采用中位數和四分位間距進行描述并制作箱圖表示,組間比較采用Kruskal-Wallis H非參秩和檢驗。計數資料采用構成比進行描述,組間比較采用卡方檢驗,P<0.05認為差異有統計學意義。組內兩兩比較進行卡方分割,對P=0.05調整為P1=P/[(k(k-1)/2)+1],k為分組數目。

2 結果

2.1 病例基本特征

94例患者納入分析,男性46人(占60.5%),女性30人(占39.5%),平均年齡59±21歲,主要的培養標本來源為痰和纖支鏡沖洗液。單病理陽性39例(41.5%),病理+培養雙陽性10例(10.6%),單培養陽性45例(47.9%)；培養結果顯示1種曲霉生長的41例,2種曲霉生長的4例。最后納入分析的有G實驗檢驗結果的病例是76例(見圖1)。

2.2 不同檢查結果組別的G實驗表現

病理+培養雙陽性的標本G實驗陽性占70%(7/10),其次是單培養陽性占37.8%(17/45),單病理陽性占14.3%(3/21)。灰區結果只有4例(分別是單培養陽性3例,單病理陽性1例)。三組的G實驗陽性率有統計學差異(χ2=9.34,P=0.036)(見表1),進行兩兩比較發現,a調整為0.0125后,雙陽性組的G實驗陽性率顯著高于單病理陽性組(χ2=9.06,P1=0.004)。以G實驗的結果制作箱圖發現,雙陽性組的G實驗中位值[M(P25,P75):249.30 pg/ml(75.5,458.25) ]顯著高于單病理陽性[40.30 pg/ml(19.65,74.25)]和單培養陽性組[79.40 pg/ml(22.75,270.60)](χ2=9.806,P=0.007)，見圖2。

2.3 霉菌分布和標本的科室來源

55例培養陽性標本中,共培養59株曲霉(4例是2種曲霉生長),最常見的是煙曲霉36例(占61.02%),其次是黃曲霉12例(占20.34%),剩下的是曲霉菌7例(11.86%)、黑曲霉3例(5.08%)和青霉屬1例(1.69%)。標本主要來源科室是呼吸內科(40.79%,31/76),危重病監護室(14.47%,11/76血液科占9.21%(7/76),其它科室有27例。

圖1 病例篩選流程圖

表1 不同證據組別的G實驗定性分析結果比較

注：*:病理+培養雙陽性 VS.單病理陽性χ2=9.06,P1=0.004

圖2 不同證據組別的G實驗定量分析結果比較

2.4 不同霉菌的G實驗結果分布

剔除掉有2種曲霉生長的病例,5種霉菌的G實驗結果如圖3所示,煙曲霉的中位值和四分位間距為： 153.30(31.10,484.80) pg/ml；黃曲霉：25.15(19.85,176.32) pg/ml;曲霉菌：262.50(48.00,271.80) pg/ml； 黑曲霉只有2例,其中位值為：112.10 pg/ml；青霉菌只有1例為：66.50 pg/ml。不同霉菌的G實驗定量結果比較未發現有統計學差異(H=4.021,P=0.403)。

圖3 不同霉菌的G實驗結果分布

3 討論

肺曲霉病臨床表現一般不典型,容易被漏診和誤診,最常見的臨床癥狀是咯血,影像學常見的是肺部結節或者暈征(Halo),特別是在免疫正常人中,癥狀更不明顯,有報道其誤診率高達73%[6]。除了癥狀不明顯,IPA的病程也較長,一項對腎移植患者進行隨訪的病例對照研究發現[7],移植后大于180發生IPA占54.5%(61/112),大部分的診斷集中在移植后的前36個月(54.1%,33/61),甚至有5個病例在移植10年后發生IPA,發生IPA的患者和對照組比起來,主要的危險因素是高齡[8]、糖尿病[9]、移植前慢性阻塞性肺病[10]、血流感染以及免疫抑制相關并發癥[11]。目前治療肺曲霉的方法主要是抗真菌治療,比如伏立康唑、兩性霉素B、卡泊芬凈、米卡芬凈等,輔助性的治療包括減停免疫抑制劑、粒細胞集落刺激因子應用或中性粒細胞輸注,部分有手術指征的患者可采用手術治療[12]。

目前診斷肺曲霉的金標準是肺組織病理檢查,但由于肺組織活檢術后易導致術后出血,患者依從性不高,導致該項侵入性操作難以開展。因此,探討其它微創或無創的方法輔助診斷IPA就很有必要,比如血清學試驗(GM實驗和G實驗)、PCR和培養法等。有報道在非中性粒細胞缺乏患者中,肺泡灌洗液(BAL)進行GM實驗診斷IPA的靈敏度和特異度分別為100.0%和76.2%[13]。BAL是來自于下呼吸道,比較接近于可能的感染灶,是比較理想的標本來源,其檢測準確性也高于其它來源的標本,比如血清標本。Zhou等[14]對非粒缺患者同時進行BAL和血清標本的GM抗原檢測,發現BAL診斷IPA的靈敏度顯著高于血清標本(75.68% VS.37.84%;P=0.001),特異度無顯著差異(80.72% VS 87.14%;P= 0.286)。但BAL標本采集需要對患者實施肺泡灌洗術,操作復雜且患者較痛苦,因此,無創性的血清學檢查正成為關注的重點,其中最為廣泛應用的是GM和G實驗。有報道在血液惡性腫瘤患者中,血清G實驗超過界值(80 pg/ml)的IPA患者占74%(22/30),血清GM實驗超過界值(ODI>0.5)的患者僅占10%,血清G實驗的靈敏度和特異度為90%(95% CI 86-96%)和85%(95% CI 79-86%),血清GM的靈敏度和特異度為30%(95% CI 26-38%)和98%(95% CI 94-100%),對于IPA的診斷,血清G實驗優于GM實驗[15]。

血清 1,3-β-D-葡聚糖實驗是很常見的非侵入性真菌診斷方法,一項納入16篇文獻、2979例患者[確診和擬診侵襲性真菌感染(IFI)594例)]的研究發現,G實驗診斷IFI的合并靈敏度和特異度分別為76.8%和85.3%[16]。對于確診或者擬診的患者,G實驗可以在臨床診斷前平均10天內出現至少一次陽性,G實驗全陰性的陰性預測值為100%,單陽性的特異度為90%；超過2次陽性的G實驗結果,其靈敏度和特異度更高[16]。本研究的結果顯示,對于單病理陽性的患者,其G實驗陽性率僅有14.3%,如果呼吸道標本培養陽性,則G實驗的陽性率可達到70%,這可能是病理陽性侵襲性肺曲霉患者的感染灶可能為局限性的曲霉感染或者早期的曲霉定植,其真菌細胞壁產物(1,3-β-D-葡聚糖)未能入血或者含量很少,導致G實驗的漏檢。而如果呼吸道標本培養陽性,其曲霉感染往往具有侵襲性或者播散性的特征,容易引起機體的免疫應答,從而引起血清中1,3-β-D-葡聚糖的升高。

本研究以確診或擬診患者作為研究對象,根據真菌培養和病理檢查的結果,分析了G實驗在上述不同檢查結果中的表現發現,培養和病理檢查均陽性的IPA患者,其G實驗的陽性率和檢測數值均較高,但單病理陽性患者陽性率很低,G實驗對這類病人存在漏診可能,要注意結合培養或者其它實驗的結果進行綜合診斷。本研究也有不足之處,比如標本量較少,部分曲霉未能進行有效鑒定等,后續的研究中會對未能準確鑒定的菌種,采取多種方法鑒定的方法進行分類,比如質譜鑒定、PCR鑒定等方法?？傊?本研究結果還是有助于分析G實驗在IPA診斷中的價值。