B族鏈球菌快速篩查及耐藥性檢測多重PCR體系構(gòu)建

祝麗晶，潘 艷，陳小穎，侯盼飛*

(1.漣水縣人民醫(yī)院 檢驗科，江蘇 漣水223400;2.上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院，上海200127)

B族鏈球菌(group B Streptococcus，GBS) 又稱無乳鏈球菌，為革蘭陽性球菌，多分布于下消化道及泌尿生殖道，是圍產(chǎn)期感染的主要致病菌。妊娠期感染可引起早產(chǎn)、流產(chǎn)、胎膜早破、胎兒窘迫等，并可引起新生兒肺炎、腦膜炎、敗血癥、窒息等[1]。研究顯示，在妊娠期對GBS篩查并對陽性者進行干預治療，可明顯降低妊娠不良結(jié)局和新生兒早發(fā)性疾病的發(fā)生[2]。本研究旨在建立GBS快速篩查及克林霉素、紅霉素耐藥性的多重PCR方法，為GBS的篩查、快速診斷和指導臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1菌株來源 GBS陽性菌株為我院臨床標本分離，經(jīng)細菌培養(yǎng)鑒定為GBS，藥敏顯示對克林霉素、紅霉素均耐藥，并經(jīng)普通PCR證實cfb、ermB和linB基因均陽性。

1.1.2試劑 Taq酶、dNTPs、Buffer等PCR反應試劑及DNA 提取試劑盒均購自上海閃晶分子生物科技有限公司。

1.1.3儀器 PCR擴增儀購自美國ABI公司，電泳儀購自上海天能有限公司，凝膠成像儀購自美國Protein Simple公司。

1.2 實驗方法

1.2.1DNA提取 采用煮沸法提取基因組DNA，具體操作按DNA提取試劑盒說明書進行。

1.2.2引物 通過Primer5.0軟件結(jié)合文獻報道[3]設計引物(序列如表1所示)，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 目的基因引物序列及預擴增產(chǎn)物

1.2.3多重PCR反應體系 總體系采用25 μl，包括：PCR buffer(含MgCl2)10 μl，dNTPs 1 μl，DNA模板0.5 μl，四對引物各0.5 μl，Taq酶0.5 μl，無菌去離子水補充至25 μl。

1.2.4多重PCR反應條件 94℃預變性3 min；94℃變性30 s，退火50 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸 5 min。為探求最佳退火溫度，我們根據(jù)引物的Tm值在50-60℃間每隔1℃設定1個退火溫度，從而優(yōu)化反應條件。

1.2.5電泳 PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察特異性條帶。

2 結(jié)果

成功構(gòu)建GBS快速篩查和耐藥檢測的多重PCR反應體系，并對退火溫度進行優(yōu)化。當退火溫度高于58℃時，linB基因未擴增出目的條帶。當溫度降至55℃以下時，會出現(xiàn)非特異性條帶。退火溫度為56℃時，3對基因均擴增出目的條帶，且亮度最為清晰。故多重PCR最適退火溫度為56℃,如圖1所示。

注： 1-6退火溫度分別為59℃、58℃、57℃、56℃、55℃、54℃；M： Marker.

圖1 不同退火溫度多重PCR產(chǎn)物電泳圖

3 討論

GBS是圍產(chǎn)期婦女感染的主要致病菌，對孕產(chǎn)婦及新生兒都可造成重大危害。歐美國家對GBS的檢測開展較早，美國疾病控制中心2010年《圍生期 B 族鏈球菌感染篩查及防治指南》提出：對所有孕婦于妊娠35-37 周采集陰道及直腸拭子進行 GBS 篩查，并對陽性者進行干預治療[4]。我國對GBS 的研究起步較晚，2010 年前全國范圍內(nèi)的篩檢幾乎空白。《孕前和孕期保健指南(2018)》將孕期GBS篩查列為備查項目[5]。青霉素是治療GBS的首選藥物，據(jù)報道有12%的孕婦對青霉素過敏[6]，且近年來GBS對青霉素的不敏感率也逐漸增高[7,8]。美國疾控中心推薦對青霉素過敏者可根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇克林霉素或紅霉素，因而快速鑒定GBS 并檢測其對克林霉素、紅霉素的耐藥性具有重要意義。

GBS檢測方法主要有微生物培養(yǎng)法和分子生物學方法。培養(yǎng)法是確診GBS感染的金標準，鑒定的同時還可進行藥敏試驗。缺點是檢測時間長、干擾因素多，靈敏度低[9]。PCR技術(shù)作為一種重要的分子生物學方法，近年來受到越來越多研究者的青睞。其具有實時、快速、準確等優(yōu)點，適用于圍產(chǎn)期篩查和緊急情況下的快速檢測，主要缺點是無法進行藥敏試驗[10]。我們在前期耐藥性監(jiān)測、流行病學分析的基礎上明確了本地區(qū)GBS的主要耐藥機制，選擇CAMP因子的cfb基因、紅霉素耐藥基因 ermB、克林霉素耐藥基因linB為靶基因，設計引物構(gòu)建多重PCR反應體系，鑒定、藥敏同步完成，一次檢測多種基因，比普通PCR節(jié)省了時間和試劑[11]。影響多重PCR的一個關鍵因素是引物設計，我們在嚴格按照引物設計原則的同時還要注意引物的特異性、避免形成引物二聚體、擴增產(chǎn)物大小易區(qū)分。另一個關鍵因素是退火溫度，我們對退火溫度進行了探索，當退火溫度在56℃、57℃時，均能擴增出3條目的條帶而不出現(xiàn)非特異性擴增，在56℃時，條帶最為清晰，是多重PCR的最適退火溫度。

本研究成功構(gòu)建GBS快速篩查和耐藥性檢測的多重PCR反應體系，在快速鑒定的同時可進行克林霉素、紅霉素耐藥性分析，彌補了普通PCR無法進行耐藥性檢測和培養(yǎng)法耗時長、陽性率低的缺點。下一步我們將對該方法靈敏度、特異性等指標進行評價，并在臨床推廣，這對GBS常規(guī)篩查、緊急情況下的快檢和青霉素過敏者的治療均具有重要意義。