子宮內(nèi)膜癌組織中AEG-1的表達及與微血管生成的關(guān)系

趙書珍，楊藝全，司軍英，楊曉萍，李 薇

(1.冀中能源峰峰集團有限公司總醫(yī)院，河北 邯鄲056000；2.邯鄲市第三醫(yī)院，河北 邯鄲056000；3.邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲056000)

子宮內(nèi)膜癌(EC)是婦科腫瘤死亡重要原因[1]，目前有關(guān)EC的發(fā)生機制尚不完全清楚。星形膠質(zhì)細胞上調(diào)基因1(AEG-1)由HIV-1或TNF-α誘導[2]，已在人類多種腫瘤中有所研究。AEG-1不僅在細胞生長的各個重要階段都發(fā)揮作用，如增殖、轉(zhuǎn)移及EMT[3]，與此同時，還參與調(diào)節(jié)并加速腫瘤血管形成[4]，目前此方面的研究主要集中在非小細胞肺癌[5]和乳腺癌[6]，但有關(guān)AEG-1與EC的關(guān)系尤其是涉及微血管生成方面研究未見報道。因此本研究采用免疫組織化學染色法檢測EC腫瘤組織中AEG-1、VEGF及腫瘤微血管內(nèi)皮標志物( CD34)的表達，并對其相關(guān)性進行分析，為EC臨床診斷及治療尋找有效靶點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本實驗選取64例邯鄲市婦幼保健院EC患者癌組織手術(shù)標本，術(shù)后診斷均經(jīng)病理證實。患者術(shù)前術(shù)后除接受EC手術(shù)外，均未行其他治療。以醫(yī)院同期35 例良性子宮肌瘤行子宮切除術(shù)患者正常組織做為對照組。患者均獲得知情同意書，并通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 免疫組織化學染色法

組織石蠟包埋、切片及脫蠟，0.3%雙氧水消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，結(jié)束后傾去殘液即可，熱源修復抗原后BSA封閉，時間到達后輕輕甩去載玻片上殘余液體。隨后37℃溫育一抗90 min，本實驗中應用的抗體均購買于北京ZSGB(兔抗人AEG-1或VEGF多克隆抗體及鼠抗人CD34 單克隆抗體)，注意一抗溫育后室溫下恢復幾分鐘再進行PBS沖洗。隨后二抗孵育20 min，根據(jù)DAB試劑盒說明進行配液后進行顯色3-5 min并觀察。

1.3 免疫染色評估

根據(jù)染色比例和染色強度評估子宮內(nèi)膜癌組織中AEG-1和VEGF蛋白的表達。將細胞呈黃色或棕色定為陽性細胞。陽性細胞百分比評分：<25%為0；25%∽50%為1；50%∽75%為2；> 75%為3。陽性強度評分：無染色0；淡黃色1；棕黃色2；顯微鏡下取不同視野仔細確定染色情況，染色百分比*強度評分=染色程度。根據(jù)染色程度分數(shù)進一步確定AEG-1在組織中表達情況，即≤2陰性染色即低表達，陽性染色≥3即高表達。

1.4 微血管密度 (MVD) 評估

采用血管內(nèi)皮標志物CD34進行染色，Weidner法計數(shù)評估。將染成棕黃色的內(nèi)皮細胞(簇)視為單個計數(shù)血管，顯微鏡下5視野平均值定為MVD 。

1.5 蛋白印記法(Western blot,WB)

樣本冰上勻漿裂解，預冷離心機后15000轉(zhuǎn)/次離心兩次，取上清液。BSA蛋白定量后，按照標準蛋白量做出標準曲線，并計算各個樣本蛋白含量，配置出標準液，隨后進行蛋白變性備用。根據(jù)蛋白大小不同配置不同濃度的膠，恒壓條件下90v凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)PVDF膜90分。牛奶封閉后一抗(1∶1000)4℃過夜，次日二抗(1∶1500)室溫2 h。沖洗后顯影液AB液1∶1暗盒混勻，將膜浸泡在黑暗處顯影液中2 min，操作曝光儀進行曝光、拍片及統(tǒng)計。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織中AEG-1呈高表達

應用免疫組化法觀察了EC組織中AEG-1表達。由圖1a,1b可見，AEG-1陽性表達主要在細胞質(zhì)中，陽性表達率可達76.6%(49/64)。正常組織中AEG-1表達呈弱染色，陽性表達率22.9%(8/35)，兩組差異顯著(P<0.05)。此外，WB結(jié)果也發(fā)現(xiàn)AEG-1在EC組織中表達顯著高于對照組(P<0.05)。以上結(jié)果表明，AEG-1在EC組織中呈高表達。

2.2 子宮內(nèi)膜癌組織中AEG-1表達與臨床病理特征相關(guān)性

將AEG-1在EC組織表達情況與臨床病理特征進行了統(tǒng)計分析(表1)。AEG-1 表達與腫瘤組織分級、FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡和肌層浸潤無相關(guān)性(P>0.05)。

圖1 AEG-1在組織中表達情況。 免疫組化檢測EC組織(a)和正常組織(b)中AEG-1表達。WB比較AEG-1在兩種組織中表達(c)，#P<0.05。

2.3 子宮內(nèi)膜癌組織中AEG-1與VEGF表達相關(guān)性

通過免疫組織化學發(fā)現(xiàn)EC組織中VEGF在細胞質(zhì)和細胞膜均有表達(圖2a,2b)，圖2c所示，AEG-1高表達(hAEG-1)組織VEGF蛋白表達量明顯高于低表達(lAEG-1)組織(P<0.05)，同時，表1也可看出，VEGF陽性率在hAEG-1組織中表達顯著，二者呈正相關(guān)(P<0.05)。

圖2 VEGF在組織中表達情況。免疫組化檢測VEGF在hAEG-1組織(a)和lAEG-1組織(b)表達；WB比較VEGF在兩種組織中表達(c)，#P<0.05。

2.4 子宮內(nèi)膜癌組織中AEG-1與MVD相關(guān)性

如圖3 所示，在AEG-1高表達EC組織中CD34表達強烈，呈棕黃色顆粒主要在細胞質(zhì)中，MVD為24.59±6.82，而CD34在AEG-1低表達EC組織中表達較弱MVD為52.18±10.43，AEG-1高表達組織中MVD水平顯著高于低表達組織，二者呈正相關(guān)(P<0.05)。

3 討論

AEG-1在多種癌癥中已發(fā)現(xiàn)顯著過表達，且與不同臨床特征如腫瘤分期、類型及轉(zhuǎn)移緊密相連。例如，非小細胞肺癌組織AEG-1過表達，與腫瘤分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[5]。Liu L 等[7]發(fā)現(xiàn)AEG-1 在子宮頸癌中表達出現(xiàn)顯著增加，并與臨床分期和病理分級呈正相關(guān)。提示，AEG-1可從臨床不同方面調(diào)控多種癌癥的產(chǎn)生及后續(xù)的延伸。不僅如此，Dong L[8]在其有關(guān)胃癌相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中AEG-1在基因及蛋白水平均發(fā)生上調(diào)，并與多種病理特征顯著相關(guān)。與上述結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)，EC組織AEG-1陽性表達顯著高于正常組織，且與腫瘤FIGO分期、組織分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。這表明，AEG-1高表達在EC發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用。提示AEG-1提高可作為EC早期診斷及預防的預測靶標。

表1 EC腫瘤組織中AEG-1表達與患者臨床病理特征比較(例)

圖3 CD34在組織中表達情況。免疫組化檢測hAEG-1組織(a)和lAEG-1組織(b)中CD34表達；兩組織中MVD結(jié)果比較(c)，#P<0.05。

眾所周知，血管生成與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此，抑制血管生成可作為腫瘤防治的有效途徑。VEGF作為重要誘導劑，可通過改變血管細胞生理特性促進血管生成。很多研究認為腫瘤細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的能力可被VEGF提高，因此，VEGF成為腫瘤發(fā)生發(fā)展重要調(diào)控因子[9]。此外也有研究發(fā)現(xiàn)AEG-1高表達可增加微血管密度，這一機制可能與激活PI3/Akt通路，增加HIFI表達，間接提高VEGF水平有關(guān)[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在AEG-1高表達組，VEGF表達及MVD微血管生成量明顯增多，且AEG-1表達與VEGF及MVD水平呈顯著正相關(guān)，提示在EC中，AEG-1可能通過增加VEGF表達及微血管生成調(diào)節(jié)EC腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但其具體調(diào)控機制有待進一步研究。

綜上所述，AEG-1不僅參與EC的發(fā)生與發(fā)展還發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，這一過程與腫瘤相關(guān)血管生成緊密相連。因此，臨床在EC治療上可將靶抑制AEG-1表達作為有效手段和途徑。