髓過氧物酶(MPO)孤立表達在急性B淋巴細胞白血病患者生存結局中的臨床價值

洪 俊,饒永彩

(1.武漢大學人民醫院 檢驗科,湖北 武漢430060；2.武漢生物制品所，湖北 武漢430060)

對急性白血病患者進行正確分類是采用最佳治療方案的關鍵。2008年世界衛生組織(WHO)關于造血和淋巴組織腫瘤中對急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)的分類診斷是基于B淋巴細胞早期分化的免疫表型證據進行定義的[1]。然而，當伴隨有顯著粒細胞或T系抗原共表達時， 2008版 WHO分類直接將這種情況歸為混合表型急性白血病(MPAL)。在新版的2016 WHO分類中也沒有對該分類方式進行修訂和更新[2]，髓過氧化物酶(MPO)的表達被認為是細胞髓系來源的確鑿證據之一；通常，典型的髓系分化往往伴隨著除MPO外的其他髓系分化證據。

然而，有研究表明[2-4]部分非典型B-ALL的免疫表型分析中會出現孤立表達MPO的現象(僅MPO表達無其他任何髓系標志表達)；盡管這種情況在客觀上符合2008年WHO關于MPAL(B系 /髓系)的標準，但不少學者一直不建議在沒有其他特征性細胞遺傳學異常情況下將這些病例草率歸于MPAL，建議慎重診斷[2-4]。此外，按照歐洲白血病免疫特征分類(EGIL)分類標準，孤立表達MPO 非典型 B-ALL免疫表型的髓系標志積分如果達不到診斷MPAL的評分閾值應直接歸為B-ALL[5]。

另外，在2016年的WHO分類更新中，提到了非典型B-ALL存在以低水平的MPO表達是其唯一的骨髓特征的現象，并指出“這一發現的臨床意義尚未確定[2]。

因此，研究孤立表達MPO的臨床意義，對于這種罕見急性白血病的準確分類，從而指導臨床治療至關重要。

有不少文獻報道過孤立表達MPO的B-ALL病例[6]。然而，關于這種病例與采用化療方案后臨床結局的關系研究很少。

本研究目的是通過對本院診斷類似病例的回顧性分析以研究孤立表達MPO 非典型 B-ALL患者在臨床預后方面與B-ALL和MPAL(B系 /髓系)的差異,非典型B-ALL中流式MPO孤立表達陽性的頻率以及流式與細胞化學和免疫組化在MPO陽性結果方面的一致性。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集于2013年 1 月- 2017年12月本院住院和門診臨床診斷為B-ALL或MPAL(B系 /髓系)的 3至35歲的兒童，青少年和成年人的骨髓、手術活檢和細胞學標本。將研究對象分成3組： B-ALL組(為對照組)、MPO孤立表達的B-ALL組(即B-ALL-iso MPO)和MPAL(B系 /髓系)組。定義B-ALL時采用CD19作為篩選免疫表型標記并加上其它的B譜系免疫表型證據。為了獲得均一的B-ALL群體作為對照組，本文排除了BCR-ABL易位病例(n=10)，MLL重排(n=29)，唐氏綜合征(n=10)，亞二倍體(n=2)和t(5;14)2例。B-ALL-iso MPO組被定義為僅MPO單獨表達(即沒有其他髓系標志物共表達)且原始細胞超過20%的非典型B-ALL。如果病例除了MPO之外還表達髓樣或單核細胞的標志物時則被指定為MPAL(B系 /髓系)。共有217例符合標準B-ALL標準，31例符合B-All-isoMPO標準，19例符合MPAL(B/myeloid)。收集的其他信息包括風險信息(高風險(HR)或標準風險(SR)(NCI / Rome標準)，治療方案，診斷年齡，性別，白細胞計數診斷，熒光原位雜交數據，細胞遺傳學數據，復發時間，死亡時間和CD標記的表達，以上所有取樣均獲得患者的知情同意書。

1.2 試劑和儀器BD Canto II流式細胞儀，美國BD公司生產。所用檢測試劑為BD公司原廠配套。

1.3 方法

1.3.1流式細胞術

流式樣本處理具體方法參見[7]，流式細胞儀檢測包括以下熒光標記單克隆抗體組合：CD10(克隆Hi10a； BD)，CD19(克隆H1B19；BD)，CD20(克隆L27；BD)，CD22(克隆HiB22和克隆S- HCL -1；BD)，CD24(克隆ML5；BD)，CD3(克隆UCHT1；BD)，CD4(克隆SK3；BD)，CD5(克隆BL1 BD)，CD7(克隆8H81；BD)，CD8(克隆SK3；BD)，CD9(克隆ML13；BD)，CD13(克隆L138；BD)，CD14(克隆MQP9；BD)，CD15(克隆MMA；BD)，CD33(克隆p67.6；BD)，CD64(克隆10.1；BD)，末端脫氧核苷酸轉移酶(TDT)(Supertechs,)，MPO(克隆8E6；Life Tech,)，CD34(克隆MY10；BD)，CD117(克隆104D2；BD)，CD45(克隆2D1；BD)，CD58(克隆IC3；BD)。采用美國BD Canto II流式細胞儀對所有樣本進行檢測，數據分析采用FACS-Diva軟件；檢測前，用CST校準微球校準流式細胞儀的電壓及增益。每個樣品測定管至少取細胞數200,000個。

通過CD45和散射光側向角(Side scatter，SSC)的特點將細胞分為淋巴細胞群、單核細胞群、粒細胞群、原始細胞群、前體細胞群及有核紅細胞群。胞內MPO與TdT所有病例均進行表達評估。將白血病細胞中MPO的表達與相應的內部陰性、同種型和陽性對照進行比較。

1.3.2免疫組化

采用Leica自動Bond系統對MPO(克隆59A5;Leica Biosystems，Newcastle，UK)進行免疫組織化學免疫組織化學分析。如果存在于淋巴母細胞上，染色被解釋為陽性。

1.3.3酶細胞化學技術

所有的骨髓片均分別進行了髓過氧化物酶(CMPO)，蘇丹黑B(SBB)，非特異性酯酶(NSE)和碘酸雪夫(PAS)以及常規的詹納-姬姆薩染色。篩選至少100個原始細胞,≥3%原始細胞的顯示為CMPO陽性時即判斷為髓系[8]。

1.3.4統計

3組患者根據性別和NCI/羅馬風險類別進行χ2檢驗。根據年齡和WBC結果進行Kruskal-Wallis檢驗，并根據復發和死亡百分比等進行Fisher精確檢驗。B-ALL-isoMPO的相對頻率計算為為占2013年至2017年在CHLA診斷的所有新發B-ALL和MPAL(B/髓樣)患者的百分比。符合正態分布資料用均值(X)±標準差(S)表示，組間比較采用t檢驗。對結果數據采用生存分析評估3組患者累計復發率CIR(形態學完全緩解后首次復發的時間)，無事件生存率(EFS)(定義為復發或死亡時間)和總生存率(OS)。采用Kaplan-Meier分析對3組患者CIR、EFS、OS進行單因素比較。

對每個結果建立單獨的Cox多元回歸模型，以評估在患者控制臨床特征之后B-ALL中MPO孤立表達的影響。P<0.05為差異有統計學意義。統計分析采用SPSS17.0軟件。

2 結果

在2013年至2017年期間，共有217例符合標準B-ALL標準，31例符合B-All-isoMPO標準，19例符合MPAL(B/myeloid)。表1總結了3組髓樣抗原表達情況。 B-ALL，BALL-isoMPO和MPAL患者的中位隨訪時間分別為44.1個月(范圍0.6-90.1個月)，48.1個月(范圍，7.5-81.7個月)和32.7個月(范圍，0.6- 71.3個月)。以上病例沒有出現MLL或BCR-ABL重排。

2.1 細胞化學、免疫組織化學和流式細胞術的MPO表達的結果缺乏一致性

在2013到2017年間所有診斷為B-ALL和MPAL的白血病病例中， B-All-isoMPO病例約占總體的 11.6%(31/267)。B-ALL、B-ALL-isoMPO和MPAL 3組的MPO流式表達水平分別為1.9%±1.5%，58.6%±20.1%，40.2%±22.0%，B-ALL-isoMPO和MPAL 組MPO表達水平顯著高于B-ALL組(t=2.43、2.35，P= 0.027、0.033<0.05)。

表1 B-ALL，BALL-isoMPO和MPAL 3組髓樣抗原表達陽性率

注：B-ALL，B細胞急性淋巴細胞白血??；B-ALISOMPO，B細胞急性淋巴細胞白血病，流式細胞術表達MPO；MPAL，混合表型急性白血??；MPO，髓過氧化物酶

31例B-All-isoMPO病例中有20例是在新鮮切割的組織上進行MPO免疫組織化學染色，其中，1例是在存檔的染色片子上進行了回顧分析。其余病例因無充足的可用組織未做化染。在以上21個MPO染色的病例中，僅有1個(4.8%)病例顯示淋巴母細胞的部分陽性染色。31例B-All-isoMPO病例中有29例進行細胞化學染色，僅1例(3.4%)陽性。細胞化學陽性病例與免疫組化(IHC)陽性的病例不是同一病例。

2.2 B-ALL-isoMPO患者MPO的流式表達模式

本文結果顯示3組患者流式MPO表達模式可以分為以下2種。第1種模式是最常見的(25/31病例)如圖1 C所示MPO表達呈從淋巴母細胞群延伸的拖尾狀表達。10例復發患者均表現出這種MPO表達模式。第2種表達模式是淋巴母細胞群大部分呈均一陽性MPO表達，(6/31病例)如圖1F所示。

2.3 CIR(累計復發率)

單因素分析結果顯示B-ALL、B-ALL-iso MPO和MPAL 3組之間的CIR差異顯著(log秩P=0.0071；圖2)。CIR的多元Cox回歸模型分析顯示(表2)，B-ALL-iso MPO組在校正年齡、WBC和性別差異后復發風險仍明顯增加(HR2.57、95 %CI 1.01-6.15、P=0.031)。與B-ALL組相比，MPAL組CIR有增加趨勢，但未達到顯著型差異水平(HR 2.70；95 %CI，0.95-7.89；P=0.80)。另外，年齡和WBC與CIR相關(P= 0.010，P<0.0001)，性別與CIR無關(P=0.910)。

圖1 B-ALL-isoMPO患者呈現兩種MPO的流式表達模式：尾狀部分表達模式：( C)，和均勻陽性表達模式(F)，TdT，末端脫氧核苷酸轉移酶。

圖2 CIR Kaplan-Meier 分析圖。單因素分析結果顯示B-ALL-iso MPO 患者復發率顯著高于B-ALL、MPAL：混合表型急性白血病(*Log-rankP=0.0071)

表2 CIR的多元Cox回歸模型分析結果

注：B-ALL，B細胞急性淋巴細胞白血病；B-ALL-isoMPO,流式MPO檢測陽性的B細胞急性淋巴細胞白血??；CI，置信區間；MPAL，混合表型急性白血病。

2.4 無事件生存率(EFS)

EFS在B-ALL、B-ALL-isoMPO和MPAL 3組中存在顯著性差異(log-rank檢驗P=0.0053)。單因素分析結果顯示B-ALL-iso MPO 患者EFS顯著低于B-ALL (log-rank檢驗P=0.0053)。圖3顯示了3組患者復發或死亡時間的Kaplan Meier曲線。

在校正年齡、WBC和性別差異后，B-ALLisoMPO組的EFS更低，但在多元Cox回歸模型(HR，2.11，95 % CI，0.89-5.10；P=0.081)中未達到顯著性差異水平。在同一模型中，MPAL組與B-ALL(HR，2.91；95 % CI，1.01-8.11；P=0.029)相比，在校正年齡、WBC和性別差異后仍有較高的復發或死亡率。另外，年齡和WBC與EFS相關(P<0.0001，P<0.0001)，性別與EFS無關(P=0.688)，表3。

2.5 總生存率(OS)

B-ALL、B-ALL-isoMPO和MPAL 3組的生存率在對數秩檢驗上差異無顯著性(P=0.7137)。圖4顯示了3組患者死亡時間的Kaplan Meier曲線。

在校正年齡、WBC和性別差異后，多元Cox回歸模型顯示B-ALL-isoMPO組與死亡沒有顯著的相關性(HR 0.93，95 %CI 0.20-3.76；P= 0.903)(表略)。另外，年齡和WBC與OS相關(P<0.0001，P=0.024)，性別與OS無關(P=0.897)(表略)。

圖3 3組患者復發或死亡時間的Kaplan Meier曲線。單因素分析結果顯示B-ALL-iso MPO 患者EFS顯著低于B-ALL、MPAL：混合表型急性白血病(*log-rank檢驗P=0.0053)。

表3 復發和死亡的多元Cox回歸模型分析結果

注：B-ALL，B細胞急性淋巴細胞白血??；B-ALL-isoMPO,流式MPO檢測陽性的B細胞急性淋巴細胞白血病；CI，置信區間；MPAL，混合表型急性白血病。

圖4 3組患者死亡時間的Kaplan Meier曲線。單因素分析結果顯示B-ALL-iso MPO 患者的生存率在與其他組相比沒有顯著性差異、MPAL：混合表型急性白血病 (* log-rank檢驗P=0.7137)。

3 討論

本文對B-ALL、B-ALL-isoMPO和MPAL 3組急性白血病患者的臨床結局進行了評估。結果表明與B-ALL組相比，在采用相同治療情況下，B-ALL-iso MPO組復發風險顯著增加。此外，B-ALL-iso MPO組主要由年齡較大的男性(86.2%男性)組成，且不伴有B-ALL常見的核型改變。在CIR和EFS上，本文結果顯示，B-ALL-iso MPO病例的累計復發率明顯升高，無事件生存率明顯下降，其特征更類似于MPAL。研究表明[9]復發是導致B-ALL死亡率的主要原因，因此，確認B-ALL患者 MPO表達與否對于患者制定最佳個體化治療方案具有重要參考價值。

酶細胞化學方法檢測判別MPO陽性的閾值是3%[10]， EGIL工作組流式MPO陽性閾值為10%[11]，但不少學者提出了不少其它的流式MPO陽性閾值設置范圍從13%到28% 不等[12,13]。當前，流式細胞術的公認MPO陽性閾值尚未正式建立。本文根據實驗室的情況設立了自身的MPO陽性閾值[14]。

本文結果表明流式MPO表達結果與免疫組化或細胞化學結果不相關。這與國外相關研究基本一致[15];其原因一方面可能與細胞化學和免疫組織化學方法學敏感性低有關，因此僅依賴于細胞化學和免疫組織化學來評估MPO的表達可能會導致假陰性；另一方面，有功能活性MPO酶的產生要在內質網中進行復雜的多步合成[16]，不同來源的抗體可能檢測到的MPO階段也不相同，本文用的單克隆抗體是檢測MPO酶原形式。這也可能是導致3種方法結果不一致的原因。此外，當前關于B-ALL流式MPO表達模式的臨床意義國內外相關研究很少,本文對此進行了觀察,發現B-ALL-isoMPO組復發的所有9例的MPO流式表達模式均呈拖尾狀表達,表明MPO流式的這種表達模式與復發可能存在一定相關性，當然還需增加病例進一步觀察。

一般而言,正常人體細胞中MPO表達陽性是細胞髓系來源的標志[16]。然而，許多對MPO RNA、蛋白表達以及超微結構的研究數據證明MPO陽性表達同樣可以出現在成人和兒童B-ALL中[17-19]。正因為如此，在2016版的WHO分類更新中，明確提到了非典型BALL存在以低水平的MPO表達是其唯一的骨髓特征的現象，并同時指出“這一發現的臨床意義尚未確定[2]，這說明MPO確實是一些急性淋巴細胞白血病的特征。有研究[20]對高危兒童B-前體急性淋巴細胞白血病病例的基因表達進行了觀察，發現有一部分是以MPO RNA高表達為特征的患者；進一步研究發現這些患者復發率高，主要以年齡較大的男性為主，且不伴MLL重排。該研究與本文分析結論非常相似，支持本文的結論。

一般而言高危B-ALL的定義是由臨床(年齡、WBC計數)和實驗室(MDR，特異性遺傳損傷)的一系列因素組合來定義的。這些亞群白血病臨床結局仍然有顯著差異，因此，進一步豐富和完善亞型分類將有利于臨床對疾病整體預后進行危險分層管理，以便能針對特定病人及時采取更精準的個體化治療。

本文研究再次表明B-all中存在一部分孤立表達MPO的BALL，對其臨床結局的分析表明這類病例代表著一種高風險的白血病，最好將其歸為一個新的BALL亞類或分類為MPAL；因為，如果在診斷BALL時忽略MPO表達情況，直接診斷為普通 B-ALL，患者就可能存在治療不足的風險。