淋巴細胞亞群在類風濕關節炎患者外周血中的表達及意義

賈淑媛,李 萍

(吉林大學中日聯誼醫院 風濕免疫科,吉林 長春130033)

類風濕關節炎(RA)是一種慢性的自身免疫性疾病,可累及關節滑膜、軟骨,嚴重者出現骨破壞[1]。目前,認為其發病機制是由環境因素、遺傳因素和免疫因素共同參與的,而T細胞調節紊亂是其主要的免疫機制[2]。但近年來,研究發現B細胞免疫功能失衡可能也參與了RA致病機制。已知B細胞不僅可以產生自身抗體,如類風濕因子(RF)、抗環瓜氨酸多肽(CCP)抗體等,形成抗原—抗體復合物沉積于關節,造成關節炎癥,也可通過抗原呈遞作用激活T細胞,并產生促炎因子[3]。然而,B細胞在RA外周血中的數量變化和是否對RA病情進展產生影響仍不清楚,同時B細胞是否直接參與了關節骨破壞存在一定的爭議。本研究主要分析了RA外周血淋巴細胞各亞群與其疾病活動性的關系,進一步探究B細胞在RA發病和病情進展中的作用,并首次根據關節骨破壞情況對RA進行分組,探討B細胞與RA關節骨破壞的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究收集了2018年1月-2018年10月于吉林大學中日聯誼醫院確診的47名RA患者,其中男性2名,女性45名,年齡(54.3±11.0)歲,病程24(4-72)個月。所有患者均符合1987年美國風濕病學會的RA分類標準[4],排除嚴重的感染、血液疾病、惡性腫瘤或患有其他自身免疫性疾病者。

1.2 方法

1.2.1淋巴細胞亞群的流式檢測 于清晨采取空腹靜脈血2 ml,離心后放入流式管中,應用流式細胞儀測定外周血中總T淋巴細胞(CD3+)、輔助性T細胞(CD3+CD4+)、抑制性T細胞(CD3+CD8+)、B淋巴細胞(CD3-CD19+)及NK細胞(CD15+CD56+)相關表面標記物表達。

1.2.2疾病活動度指標 收集RA患者資料,包括姓名、年齡、性別、壓痛關節數(TJC)、腫脹關節數(SJC)、類風濕因子(RF)、紅細胞沉降率(ESR)、C-反應蛋白(CRP)、抗環瓜氨酸多肽(CCP)抗體、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、關節X線平片。根據上述資料,計算28個關節的疾病活動評分,計算公式為DAS28-CRP(3)=[0.56×sqrt(TJC28)+0.28×sqrt(SJC28)+0.36×In(CRP+1)]×1.10+1.15。按照DAS28-CRP(3)將RA患者分為2組,DAS28-CRP(3)≤5.1為低中度疾病活動組(22例),DAS28-CRP(3)>5.1為高度疾病活動組(25例)。在這47例RA患者中做過雙手關節X線片的共計37人,根據RA患者雙手關節X線平片,評估骨破壞情況,分為有關節骨破壞組(20例)和無關節骨破壞組(17例)。

1.3 統計學處理

所有數據采用SPSS24.0軟件統計處理,正態分布計量資料以均數±標準差表示,非正態分布數據以中位數(四分位間距)表示。正態分布數據差異性采用獨立樣本t檢驗,相關性采用Pearson相關性分析,非正態分布數據差異性采用秩和檢驗,相關性采用Spearman相關性分析。以P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 RA患者外周血淋巴細胞各亞群與RA病情活動性的關系

根據DAS28評分將RA患者分為低中疾病活動組和高疾病活動組(見表1),采用流式細胞術分別檢測兩組RA患者外周血中淋巴細胞各亞群的表達情況。在高疾病活動組中外周血CD3-CD19+B淋巴細胞水平10.2%(8.5%-13.0%)明顯高于低中疾病活動組(8.6%±2.3%)(P<0.05),而CD3+T淋巴細胞、CD3+CD4+T淋巴細胞、CD3+CD8+T淋巴細胞、CD16+CD56+NK細胞表達水平及CD3+CD4+/CD3+CD8+比值在兩組間的差異無統計學意義(P>0.05)。(見表2)

表1 低中疾病活動組和高疾病活動組的基本特征

2.2 CD3-CD19+B淋巴細胞水平和RA疾病活動性的相關性

上述實驗已經證實高疾病活動組CD3-CD19+B淋巴細胞水平較低中疾病活動組明顯升高。為進一步探究其在RA發病中的作用,本研究分析了RA患者外周血CD3-CD19+B淋巴細胞和患者疾病活動性指標的相關性,結果顯示CD3-CD19+B淋巴細胞水平與DAS28-CRP(3)(r=0.304,P=0.037)、壓痛關節數(r=0.298,P=0.042)、腫脹關節數(r=0.343,P=0.018)、IgA(r=0.378,P=0.010)成明顯正相關,與ESR、CRP、PF、抗CCP抗體、IgG、IgM無明顯相關性(P>0.05)。(見表3)

表2 RA患者外周血淋巴細胞各亞群與RA病情活動性的關系

注:“*”表示P<0.05

表3 RA患者外周血CD3-CD19+B淋巴細胞水平與RA疾病活動性指標的相關性

注:“*”表示P<0.05

2.3 CD3-CD19 B淋巴細胞水平和關節骨破壞的關系

為研究B細胞和RA關節骨破壞之間的關系,本研究將RA患者分為關節骨破壞組和無關節骨破壞組,比較了兩組間外周血CD3-CD19+B淋巴細胞的水平。關節骨破壞組外周血CD3-CD19+B淋巴細胞水平為10.25%(8.50%-12.60%)明顯高于無關節骨破壞組(8.97%±2.36%)(P=0.046)。(見圖1)

注:“*”表示兩組間比較P<0.05

3 討論

RA的發病機制目前尚不明確,研究認為其發病可能與T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞的數量和功能紊亂有關。CD19是一個分子量為95 kDa的免疫球蛋白超家族成員,表達于除漿細胞之外的分化發育各階段B淋巴細胞表面[5]。CD19對B淋巴細胞的生成、活化、增殖及其信號轉導起重要的作用,當體內B淋巴細胞表面的CD19分子異常表達時可能導致疾病發生。動物實驗表明在轉基因小鼠中CD19過度表達可產生大量自身抗體,誘導自身免疫病的發生[6]。同時B淋巴細胞靶向治療藥—利妥昔單抗已在臨床上得到廣泛應用,它主要通過消耗B淋巴細胞來改善RA患者的臨床癥狀,其療效也獲得了很好的肯定[7,8]。本次研究發現在RA患者外周血中CD3-CD19+B淋巴細胞數量在高疾病活動組較低中疾病活動組明顯升高,且B淋巴細胞數量和DAS28成明顯正相關性。這和潘惠[9]等人研究結果相似,提示B淋巴細胞可能參與RA的發病機制,抑制B淋巴細胞的產生有助于阻止RA的發生,且外周血中的B淋巴細胞可能可以作為評估RA患者疾病嚴重程度的指標之一。而B淋巴細胞水平和血IgA水平呈正相關,提示RA患者B細胞過度表達和免疫球蛋白產生有關。

RA骨破壞機制十分復雜,目前公認破骨細胞是導致骨破壞的重要因素[10],而核因子κB受體活化因子配體(RANKL)是破骨細胞分化的關鍵分子之一[11]。之前研究認為激活的T淋巴細胞表達RANKL,后者和其受體RANK結合后,誘導破骨細胞生成和活化,并抑制其凋亡,從而使破骨細胞數量增加[12],骨重吸收和骨重建調節失衡,最終導致骨破壞。近幾年研究發現RANKL也表達于B淋巴細胞表面[13],提示B淋巴細胞可能也參與了骨破壞的發生。已有研究證明B淋巴細胞產生的抗瓜氨酸蛋白抗體(ACPA)可識別破骨細胞及其前體細胞表面的瓜氨酸波形蛋白,從而增加破骨細胞的生成和分化,促進骨重吸收,介導骨破壞發生[14]。說明B淋巴細胞除了產生自身抗體介導骨破壞發生之外,也能通過非抗體依賴途徑直接參與骨破壞的發生。本研究首次發現RA關節骨破壞組中外周血CD3-CD19+B淋巴細胞水平較無關節骨破壞組明顯升高,提示B淋巴細胞可能參與了RA骨破壞形成。

CD3+表達于所有T細胞表面,故認為CD3+T細胞為總T細胞,按其表面抗原的表達分為輔助性T(Th)細胞和抑制性T(Tc)細胞,分別表達CD3+CD4+和CD3+CD8+。CD4+T細胞通過增加白細胞介素-6、白細胞介素-17、腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性因子分泌,減少IL-10、INF-α等抑炎因子分泌,促進RA的發展。而CD8+T在RA致病機制中的作用并不顯著。本研究發現在RA高疾病活動組和低中疾病活動組中CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞水平及其比值未見明顯變化。這和梅序橋[15]等人的實驗結果相似,他們研究發現在不同活動性RA患者外周血中T淋巴細胞亞群水平無明顯變化,但和正常人比較CD4+T細胞明顯減少。

NK細胞主要參與機體固有免疫,具有抗感染、抗腫瘤和免疫調節等作用。研究發現在RA患者滑膜中有大量NK細胞的沉積[16]。但NK細胞在RA中的作用仍不清楚,且RA患者外周血中NK細胞的數量變化也存在爭議,有些研究發現NK細胞數量正常,而有些研究提示其數量減少[16-18]。本研究發現NK細胞在高疾病活動組和低中疾病活動組中無明顯變化。故NK細胞在RA中的致病機制和治療中的潛在應用尚需進一步研究證實。

綜上所述,本研究發現B淋巴細胞水平與RA疾病活動性有關,且首次證實了在RA關節骨破壞組中CD3-CD19+B淋巴細胞數量明顯升高,抑制B淋巴細胞可能對治療RA關節骨破壞提供新的思路。