SAMHD1參與逆轉(zhuǎn)座子LINE-1調(diào)控在白血病發(fā)病中的機制研究

魏宇鵬,關寶杰

(吉林省一汽總醫(yī)院,吉林 長春130011)

LINE-1 (long interspersed nuclear elements-1)是現(xiàn)今人體內(nèi)唯一具有自主轉(zhuǎn)座活性的逆轉(zhuǎn)座子，廣泛分布于基因組中[1]。宿主細胞對LINE-1的轉(zhuǎn)座有著嚴格地控制，在正常分化的細胞中，LINE-1的啟動子為高度甲基化狀態(tài)，造成沉默[2，3]。當機體對LINE-1的控制能力減弱時，基因組的穩(wěn)定性會受到巨大威脅[4]，進而引發(fā)基因缺陷性疾病甚至癌變。有研究表明在幾乎所有的腫瘤細胞中LINE-1均為激活狀態(tài)。了解機體對于LINE-1的調(diào)控機制，對于理解這些疾病的發(fā)生至關重要。SAMHD1蛋白(SAM domain and HD domain containing protein 1)最早在人樹突狀細胞(DCs)的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)[5]。SAMHD1是人體唯一已知的dNTP水解酶，通過控制細胞內(nèi)dNTP池的豐度參與體內(nèi)核酸調(diào)控，在維持基因組穩(wěn)定的過程中發(fā)揮著關鍵作用[6],SAMHD1的突變是免疫缺陷性疾病AGS的重要誘因[7]。作為宿主細胞的天然抗病毒因子，SAMHD1被發(fā)現(xiàn)具有廣譜的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒和DNA病毒功能[5]。LINE-1的轉(zhuǎn)座與逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合過程十分相似，SAMHD1同樣也是人體調(diào)控LINE-1活性的關鍵蛋白，隨著LINE-1檢測方法的優(yōu)化，在多種腫瘤和癌變組織中發(fā)現(xiàn)了大量LINE-1轉(zhuǎn)座的證據(jù)，這種LINE-1的異常活化現(xiàn)象往往反映了較深的癌變程度[8]。結合SAMHD1頻繁突變在白血病、大腸癌、肺癌和肝癌中的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，提示我們LINE-1的轉(zhuǎn)座增加與SAMHD1的頻繁突變很可能存在某種聯(lián)系。SAMHD1的突變導致LINE-1異常活化，可能是白血病等多種腫瘤發(fā)生的重要誘因。白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病，在我國發(fā)病率在各種腫瘤中在第六位。目前對于白血病的發(fā)病機制仍然缺乏了解。本研究選取來自白血病中的SAMHD1突變體，探討其對于逆轉(zhuǎn)座LINE-1的活性影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象參考國內(nèi)外白血病來源的樣本中的SAMHD1突變信息，選取3個突變位點，其可能位于SAMHD1的活性中心、變構中心、四聚體形成的交界面等關鍵位置。分別是E355K,T365P,P158S,以野生型SAMHD1(109aa-626aa)為對照。

1.2 研究方法

1.2.1SAMHD1相關突變體在體外表達及純化 選定的SMAHD1突變位點，分別將其構建到原核表達載體pET28a和真核表達載體VR1012上。BL21(DE3)預表達SAMHD1 WT及相關突變體，當OD600是0.6時，0.5 mM IPTG，16℃誘導過夜。次日收菌，超聲破碎，3 000 rpm/5 min，離心去細胞碎片，然后收集上清，12 000 rpm/20 min分離可溶性蛋白及不可溶性蛋白，用Western Blot檢測蛋白表達情況。將表達好的突變體擴大培養(yǎng)，先用鎳柱親和層析純化，繼續(xù)用凝膠過濾層析(GE Superdex 200)純化，分離得到SAMHD1單體，BCA法測量SAMHD1單體蛋白濃度并分裝，-80℃保存，為接下來的一系列實驗做準備

1.2.2檢測SAMHD1相關突變體dNTPase活性。分別取等量純化好的SAMHD1 WT及各種突變體單體蛋白，加5 mM MgCl2，0.5 mM dGTP，25℃分別誘導0.5 h，6 h，24 h后，終濃度10 mM EDTA終止反應。樣品用10 kd超濾管超濾后12 000 g/20 min，離心，達到除去SAMHD1蛋白(70 kd)及雜質(zhì)的目的。收集反應產(chǎn)物并用HPLC(安捷倫)分離，分離柱子：150×2.0 mm C18 柱子 (Phenomenex)。用260 nm波長檢測產(chǎn)物。使用標準品dG校正產(chǎn)物的出峰位置。

1.2.3SAMHD1 WT及突變體抗LINE-1的活性檢測 使用99-PUR-L1RP-EGFP載體檢測突變體抗LINE-1的活性，其包含一個可篩選的抗性基因-Puro，該表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后,其反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需要經(jīng)過剪切和拼接，并插入基因組后，細胞才能表達EGFP。陰性對照為JM111。EGFP的陽性率通過流式細胞儀檢測，可以直接反映LINE-1的轉(zhuǎn)座活性。實驗過程：第1天HEK293T鋪板，第2天細胞密度達到20%左右，將1.5 μg 99-PUR-L1RP-EGFP分別與空載體，SAMHD1及突變體質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染EK293T，陰性對照是JM111。轉(zhuǎn)染后48 h，將培養(yǎng)基換成10% FBS的DMEM并含有5 nmol Puro，繼續(xù)培養(yǎng)2 d后收細胞， LINE-1的EGFP陽性率用流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 SAMHD1及其突變體的表達情況pET28a-SAMHD1-WT及3個突變體在大腸桿菌中預表達，蛋白免疫印跡檢測，結果表明(圖1a)所有的突變體均表達，但是E355K、T365P突變體的可溶性表達的蛋白量比較少。VR1012-SAMHD1-WT及3個突變體在真核表達系統(tǒng)HEK293T細胞中表達，SAMHD1 WT及3個突變各轉(zhuǎn)染100 ng，表達結果如圖(圖1b),均可表達， T365P表達較弱，推測這突變導致蛋白不能正確折疊,所以導致它們在原核和真核表達系統(tǒng)中的表達量均受到影響，這也可能影響其發(fā)揮功能。

(a)SAMHD1突變體在大腸桿菌中的表達情況(S:上清；P:沉淀)。(b) SAMHD1突變體在293T細胞中的表達情況

2.2 SAMHD1野生型及其突變體dNTPase活性檢測純化獲得SAMHD1野生型和不同突變體的蛋白，利用高效液相色譜法檢測其dNTPase活性，結果(圖2)表明與野生型相比，3個SAMHD1突變體的dNTPase活性均有顯著下降，說明選取的3個白血病相關SAMHD1突變體都失去了dNTPase活性。

圖2 SAMHD1突變體dNTPase活性的檢測

2.3 SAMHD1及其突變體抑制LINE-1活性的檢測在HEK293T共轉(zhuǎn)染SAMHD1和LINE-1質(zhì)粒，48 h后加puro篩選，96 h后流式細胞儀檢測EGFP的比率，結果表明(圖3)5個SAMHD1突變體在抑制LINE-1方面均存在缺陷，大多數(shù)沒有dNTPase活性的SAMHD1突變體，其抑制LINE-1的能力也顯著減弱。

3 討論

目前人們對于SAMHD1抑制LINE-1的分子機制仍所知有限。2013年趙可等人首次發(fā)現(xiàn)SAMHD1通過抑制LINE-1的ORF2p表達，進而抑制LINE-1的活性，突變體D311A沒有dNTPase活性，還有部分抑制LINE-1的能力[9]；2015年，郭斐團隊發(fā)現(xiàn)SAMHD1通過增加細胞內(nèi)的eIF2α磷酸化和解聚eIF4A/eIF4G復合物促進應急顆粒的形成，限制LINE-1核糖體蛋白復合物RNPs從胞漿轉(zhuǎn)移到胞核內(nèi)，從而抑制LINE-1的轉(zhuǎn)座，失去dNTPase酶活的SAMHD1突變體，不能通過隔離LINE-1的RNPs抑制LINE-1的活性，并認為dNTPase酶對抑制LINE-1很關鍵；在結構方面，有研究證明，鋅離子結合位點(His167、His206、Asp207、Asp311)的突變會破壞蛋白與鋅離子的結合，使突變體都喪失dNTPase活性，在不同的文獻上發(fā)現(xiàn)這些突變體在不同程度上失去對LINE-1的抑制。SAMHD1 S33位點在韓國人群中存在多態(tài)性，當引入小殘基突變時，其失去抑制LINE-1轉(zhuǎn)座的能力；2018年，研究者發(fā)現(xiàn)SAMHD1 的592位發(fā)生磷酸化缺陷的突變(T592A)時，可以顯著增強其對LINE-1逆轉(zhuǎn)錄的抑制。上述研究者分別從不同角度研究了SAMHD1抑制LINE-1的過程，證明有多種因素影響著SAMHD1對LINE-1的調(diào)控，尤其SAMHD1的dNTPase活性對其抑制LINE-1的影響眾說紛紜。借助來源于臨床腫瘤組織的SAMHD1突變信息，通過構建突變體，考察SAMHD1抑制LINE-1的可能機制，將有助于我們更真實、更深刻地了解SAMHD1抑制LINE-1逆轉(zhuǎn)座活性這一重要的生理過程。

圖3 SAMHD1突變體抑制逆轉(zhuǎn)座子LINE-1活性檢測

本研究選取的來源于白血病樣本中SAMHD1突變，其dNTPase活性均出現(xiàn)明顯下降，而其抑制逆轉(zhuǎn)座子LINE-1的能力也同樣顯著降低。SAMHD1具有dNTPase活性是維持體內(nèi)核酸穩(wěn)態(tài)的關鍵，其可以通過降低細胞內(nèi)dNTP水平，控制逆轉(zhuǎn)座子的活性，維持基因組穩(wěn)定性。SAMHD1在白血病、結腸癌等腫瘤中的突變和下調(diào)，預示著其可能是潛在的抑癌基因，而SAMHD1突變與逆轉(zhuǎn)座子LINE-1活化間的關聯(lián)，又為相關腫瘤的診療和預判提供新的思路。