紅景天甙影響SACC-2細胞凋亡途徑相關蛋白表達的體外研究

張曉恬,林佳慧,楊 格,范婧婧,高志琴,王醫術,李美華*

(1.吉林大學第二醫院 口腔科，吉林 長春130041;2.吉林大學 病理生物學教育部重點實驗室,吉林 長春130021)

紅景天甙(Salidroside)也稱紅景天苷，其取自景天科紅景天屬植物大株紅景天干燥的全草、根莖，是紅景天中高活性、最有效的成分之一。紅景天作為一種傳統的天然中草藥，被認為具備增強免疫水平、抗疲勞、抗氧化及抗腫瘤等多種作用，在國內已有廣泛研究與應用[1]。紅景天抗腫瘤作用的相關研究顯示，紅景天苷能夠通過下調Bcl-2的表達水平誘導人BC細胞的周期停滯和凋亡，也可通過增加脾淋巴細胞轉化率和IL-2值來明顯抑制人胃癌細胞系BGC-823的生長，反映了其在抗腫瘤藥物治療方面的良好前景[2,3]。然而，涎腺腺樣囊性癌(saliva adenoid cystic carcinoma，SACC)作為最常見的唾液腺惡性腫瘤之一，臨床上少有紅景天甙對此種腫瘤的作用及其機制的研究，因此，本實驗擬通過Western blot實驗檢測不同濃度紅景天甙處理對SACC-2細胞凋亡途徑相關蛋白如Bax、Bcl-2、LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ表達的影響，觀察紅景天甙作用于SACC細胞后對其增殖及凋亡影響的藥理作用，并探究其可能發生機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紅景天甙由吉林省中研藥業有限公司提供；標準胎牛血清由天津灝洋生物公司提供；胰蛋白酶(GIBCO公司)；BAX、BCL-2、LC3(abcom公司，USA)；超凈工作臺(SW-CJ-1F)、CO2恒溫培養箱、4℃冰箱、-80℃超低溫冰箱由吉林大學病理生物學教育部重點實驗室提供。

1.2 細胞總蛋白樣品制備

實驗分為對照組與紅景天甙用藥組，SACC-2細胞在10%胎牛血清的1640培養基中培養，將2.5 μg/ml及5 μg/ml濃度的紅景天苷分別加入用藥組的培養基中。待每皿內細胞的融合程度達90%左右，棄培養基，胰酶消化離心，冰上裂解30 min，每5 min渦旋一次。并運用BCA試劑法測定蛋白濃度，按照計算顯示蛋白濃度配置電泳所需蛋白樣品，備用。

1.3 Western Blot分析

SDS—PAGE電泳，濃縮膠恒壓80V，40 min；分離膠恒壓120V，3 h。電泳結束手轉膜，轉膜采用半干轉，恒壓，40 min；后將PVDF膜在5%的脫脂奶粉封閉液中浸泡，封1 h，室溫下搖床孵育；然后加入一抗、二抗，TBST洗膜3次/10 min,之后進行化學發光反應；ECL顯色。

1.4 統計學分析

實驗結果的數據統計及數據統計的分析分別采用均數±標準誤(Mean±SE)和SPSS17.0，而單變量兩組資料間比較和參數間相關分析則分別采用t檢驗和Pearson檢驗，P<0.05時具有統計學意義。

2 結果

Western blot實驗結果顯示，促凋亡蛋白BAX在2.5 μg/ml用藥組的表達與對照組相比差異不明顯，但5 μg/ml用藥組的與對照組及2.5 μg/ml用藥組相比表達均降低(對照組&2.5 μg/ml用藥組，P>0.1；對照組&5 μg/ml用藥組，P<0.0001；2.5 μg/ml用藥組&5 μg/ml用藥組，P<0.0001)，抗凋亡蛋白BCL-2表達降低(對照組&2.5 μg/ml用藥組，P<0.05；對照組&5 μg/ml用藥組，P<0.05；2.5 μg/ml用藥組&5 μg/ml用藥組，P<0.05)，但BCL-2/bax比值降低(對照組&2.5 μg/ml用藥組，P=0.1431；對照組&5 μg/ml用藥組，P<0.05；2.5 μg/ml用藥組&5 μg/ml用藥組，P<0.05)。與對照組相比，2.5 μg/ml用藥組和5 μg/ml用藥組自噬相關蛋白LC3-Ⅰ表達均降低，LC3-Ⅱ表達均增高，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增高(對照組&2.5 μg/ml用藥組，P<0.05；對照組&5 μg/ml用藥組，P< 0.05)。(圖1、表1)

圖1 不同濃度紅景天甙對SACC-2細胞Bax、Bcl-2、LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ表達的影響

表1 Western blot檢測不同濃度紅景天甙對SACC-2細胞凋亡途徑相關蛋白表達影響的統計分析

3 討論

細胞凋亡(apoptosis)與細胞自噬(autophagy)被認為是機體內程序性細胞死亡((programmed celldeath,PCD)的兩種重要形式，也是維持體內細胞穩態的重要手段。凋亡是細胞為維持體內穩定的內環境而按照一定規律和程序自動停止生命的基本生物學現象，而腫瘤細胞在過度增殖及凋亡程序的紊亂兩方面的行為改變往往會導致惡性腫瘤的產生。因此，實現促進細胞凋亡過程的再啟動被認為是治療腫瘤行之有效的方法之一，目前臨床上許多化療藥物均是通過誘導或上調腫瘤細胞凋亡水平來發揮其藥理作用[4]。而生理水平的自噬則是機體內一種保守的細胞自我降解方式，通過清除、降解細胞內受損細胞及生物大分子，為細胞的修復、重建和再生提供原料，實現細胞內物質的再利用。自噬水平異常(過度或不足)均可能致使有關疾病的產生有可能因為，腫瘤細胞在氧分、血供及營養不足、腫瘤對抗治療等這類細胞“惡性”外部代謝環境下體現出的調亡抵抗，可以提高其逆境生存的能力。細胞自噬作為腫瘤細胞逃逸凋亡的某種特殊作用機制，正逐漸作為腫瘤發生機制與對抗治療研究中的熱點而被關注[5]。

本實驗中，為了驗證不同濃度紅景天甙影響SACC-2細胞凋亡的藥理效用，我們采用Western blot實驗測試了Bax、Bcl-2、LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ等多種蛋白的表達水平。Bcl-2與Bax同屬于Bcl-2家族，該凋亡調控基因表達的這兩種重要蛋白可聚合為同/異源二聚體來發揮其對細胞凋亡的調節作用。當下對Bcl-2普遍認認知是其可以通過對凋亡基因Bax產生對抗作用，或拮抗細胞色素c的釋放，以及阻止caspase被包含于胞質中的細胞色c激活，從而發揮其抗凋亡機制[6,7]。有研究顯示Bax/Bcl-2 兩種凋亡相關蛋白之間的比例大小能夠在某種水平上體現細胞凋亡受抑制作用的強度水平，因此可以認為，Bax 是促進細胞凋亡的基因中較為重要的一種。而自噬標志物LC3在形成自噬反應時，LC3-Ⅰ會因某一多肽小片段的酶解而轉化為LC3-Ⅱ，因此根據LC3-Ⅱ/Ⅰ比例的改變，可以預估細胞自噬反應程度的高低[8]。

后續檢測結果顯示，2.5 μg/ml紅景天甙用藥組蛋白表達差異不明顯，5 μg/ml紅景天甙用藥組與對照組相比，Bax表達亦降低，Bcl-2表達降低，但Bcl-2/Bax比例值也同樣降低，該比值減低說明與對照組相比，5 μg/ml紅景天甙用藥組抗凋亡作用弱于促凋亡作用。而LC3表達情況的檢測結果則反映，隨著紅景天甙濃度的上升，LC3-Ⅰ表達降低，LC3-Ⅱ表達增高，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增高，由此可以認為紅景天甙能夠導致SACC-2細胞自噬水平的增加。

本研究證實了紅景天苷能夠通過促進SACC-2的凋亡來抑制其增殖，從而發揮其腫瘤治療作用，其機制可能與細胞自噬調節相關。我們將通過后期體內研究進一步明確紅景天苷在抑制SACC細胞增殖反應中的分子作用機制。