GATA4在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

王 煉,喬 昕,張軼西,劉 斌,孫軼夫,汪 宏,喬士興*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 肝膽外科，吉林 長(zhǎng)春130041；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院 麻醉科，北京100020；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，廣東 廣州510080)

肝細(xì)胞癌(HCC)是全世界死亡率排第三位的惡性腫瘤，每年大約50-60萬(wàn)人死于肝癌[1,2]。 HCC發(fā)展是由遺傳易感性、環(huán)境因素、代謝綜合征、酒精和黃曲霉毒素B1等和病毒感染相互作用產(chǎn)生的[3]。近年來，隨著治療手段的不斷改進(jìn)，根治性手術(shù)切除對(duì)早期肝癌患者效果較好，而對(duì)于中、晚期肝癌患者即使根治切除，5年生存率仍然非常低[4]。因此，肝癌的早期診斷對(duì)提高肝癌患者的總體生存率具有十分重要的意義。目前影像學(xué)檢查是肝癌診斷的常用方法，而血清標(biāo)志物具有易檢測(cè)、可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，在肝癌診斷中占有重要地位。甲胎蛋白(AFP)是全世界應(yīng)用最廣泛的肝癌腫瘤血清標(biāo)志物[5]，但敏感性、特異性并不理想[6]。因此，探索敏感性和特異性更高的肝癌早期診斷標(biāo)志物成為目前研究熱點(diǎn)。

GATA4是轉(zhuǎn)錄因子GATA家族的成員之一，GATA4 主要在內(nèi)胚層和中胚層來源的組織和器官中表達(dá)。研究證實(shí)，GATA4 在小鼠的胚胎發(fā)育中有著調(diào)節(jié)發(fā)育以及具有組織特異性表達(dá)的特點(diǎn)。在小鼠的胚胎發(fā)育過程中GATA4 的mRNA 可在多種器官中檢測(cè)到，如心臟、腸、生殖腺、肝臟，內(nèi)臟以及腔壁內(nèi)胚層等[7]。在肝臟的發(fā)育過程中，GATA4起到非常重要作用[8]。在HCC中GATA4介導(dǎo)的反式激活可抑制肝細(xì)胞上皮分化功能[9]。GATA4在肝癌細(xì)胞中高表達(dá),并能促進(jìn)正常肝細(xì)胞增殖,促進(jìn)FTF、AFP的表達(dá),可能參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展[10]。此外，GATA4的轉(zhuǎn)錄活性與肝癌細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)[11]。然而，部分研究證實(shí)GATA4在肝癌中低表達(dá)[9,12,13]。總之，GATA4在肝癌中的表達(dá)模式至今還存在爭(zhēng)議。 本文旨在探討GATA4在肝癌細(xì)胞中表達(dá)模式，并驗(yàn)證GATA4表達(dá)改變對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的影響。以期為肝癌的早期診斷和治療提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料GATA4兔抗人多克隆抗體購(gòu)自abcam公司，GAPDH兔抗鼠單克隆抗體、山羊抗鼠IgG(H+L)和山羊抗兔IgG(H+L)購(gòu)自碧云天。本實(shí)驗(yàn)所有細(xì)胞(正常肝細(xì)胞HL-7702、肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721、Hep3B和腎上皮細(xì)胞293T)均由吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院惠贈(zèng)。TRIzol、可替代LIPO2000、MTT試劑盒均購(gòu)自美倫生物科技有限公司。GATA4過表達(dá)慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。GATA4干擾質(zhì)粒、GATA4引物和GAPDH引物均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)采用人類正常肝細(xì)胞(HL-7702)、肝癌細(xì)胞株(HepG2、SMMC7721、Hep3B)用含10% 胎牛血清的1640、DMEM和MEM培養(yǎng)液(其中HL-7702用1640培養(yǎng)液，HepG2和Hep3B用MEM培養(yǎng)液、SMMC7721用DMEM培養(yǎng)液)，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。用于轉(zhuǎn)染的293T 細(xì)胞用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2RT-PCR法檢測(cè)GATA4mRNA的表達(dá)水平 用TRIzol提取總RNA。2 μg純化的RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書在PCR儀中合成cDNA。根據(jù)RT-PCR試劑說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，GATA4上游引物5’-CTGGCCTG TCATCTCACTAC-3’，下游引物5’-TTACGCAGTGAT TATGTCCC C-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物5’-GTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3’，下游引物 5’-ACC ACCTTC TTGATGTCATCAT-3’。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性，酶激活(30 s)95℃變性(5 s)，60℃(30 s)，40個(gè)循環(huán)。最后所得Ct值用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。PCR反應(yīng)每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，最后取平均值。

1.2.3GATA4高表達(dá)和沉默模型制備 GATA4過表達(dá)慢病毒(GATA4)由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，GATA4-siRNA干擾質(zhì)粒(GATA4-siRNA#1正義鏈5’-GGCAGAGAGUGUG UCAACUTT-3’，反義鏈5’-AGUUGACAC AUCUCUGCCTT，GATA4-siRNA#2正義鏈5’-GCCUCUU GCAAUGCGG AAATT-3’，反義鏈5’-UUUCCGCAUUGCAAGAG GGCTT-3’)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并提供合成結(jié)果。過表達(dá)模型制備，實(shí)驗(yàn)分為兩組：(1)對(duì)照組(Vector組)，(2)實(shí)驗(yàn)組(GATA4組)。用293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，用病毒液感染HepG2細(xì)胞，嘌呤霉素篩選2周，GATA4過表達(dá)細(xì)胞用Western Blot檢測(cè)。沉默模型制備，本實(shí)驗(yàn)分為兩組：(1)對(duì)照組(NC組)，(2)實(shí)驗(yàn)組(GATA4-siRNA組)。Hep3B用1 μg GATA4-siRNA質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑(可替代LIPO2000)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，24 h后用Western Blot 進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4增殖實(shí)驗(yàn) 用MTT試劑檢測(cè)細(xì)胞增殖率，該實(shí)驗(yàn)完全按照MTT試劑說明書進(jìn)行操作。在96孔板中種植細(xì)胞2000個(gè)，每個(gè)樣本種5個(gè)復(fù)孔，用含10%FBS的MEM培養(yǎng)基，5%CO2，37℃孵育。第2天每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)使結(jié)晶溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定其吸光值，根據(jù)測(cè)得吸光度值(OD)來判斷活細(xì)胞數(shù)量。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn) 先用Marker筆在6孔板背后，均勻劃?rùn)M線，大約每隔0.5-1 cm劃一道，每孔至少5條線。在6孔板種植細(xì)胞(5×105個(gè)細(xì)胞/孔)，每種細(xì)胞種植3個(gè)復(fù)孔。至細(xì)胞鋪滿后，用槍頭和直尺，垂直于后面的橫線在細(xì)胞中劃痕，用PBS洗掉劃下的細(xì)胞，加入無血清的培養(yǎng)基放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按0、24、48 h取樣拍照。

1.2.6Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 用BD公司的Matrigel1∶8稀釋，包被Transwell 小室底部膜的上面，至37℃1 h使Matrigel聚合成凝膠。消化細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整到5×105/ml，取100 μl細(xì)胞懸液加入小室。24孔板下室加入600 μl含20%FBS的MEM培養(yǎng)基，24 h后取出小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣PBS洗兩遍，多聚甲醛固定30 min,將小室風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽擦掉上層未遷移的細(xì)胞，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.2.7Western Blot 用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，BCA試劑盒(碧云天)嚴(yán)格按說明書操作測(cè)蛋白濃度。每孔加入30-50 μg標(biāo)準(zhǔn)化蛋白樣品，在加滿Tris-Glycine電泳液的垂直電泳槽內(nèi)，濃縮膠80 V恒壓電泳至分離膠界面時(shí)，調(diào)至120 V繼續(xù)電泳至溴酷藍(lán)分離膠底部。轉(zhuǎn)移至聚PVDF膜，用指定的一抗室溫孵育2 h或4℃孵育過夜。 TBST洗5 min共3次，加入二抗室溫孵育1 h。取出PVDF膜，洗5 min共3次；吸干膜上液體，于潔凈保鮮膜上加ECL工作液反應(yīng)2-5 min；暗室內(nèi)壓片、顯像，結(jié)果使用Quanlitiy one 分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析：計(jì)量資料組間差異采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間差異采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn),雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mRNA水平GATA4在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，蛋白質(zhì)水平低表達(dá)

用RT-PCR檢測(cè)GATA4在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GATA4在正常肝細(xì)胞(HLLP-7702)和肝癌細(xì)胞(HepG2)中低表達(dá)，在肝癌細(xì)胞系(Hep3B和SMMC7721)中高表達(dá)(圖1A)。用western blot檢測(cè)GATA4蛋白在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GATA4蛋白在正常肝細(xì)胞(HL-7702)和肝癌細(xì)胞系(HepG2、Hep3B和SMMC7721)中均低表達(dá)(圖1B)。

注：A:用RT-PCR檢測(cè)GATA4在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，GATA4在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞HepG2中低表達(dá)，在肝癌細(xì)胞SMMC721和Hep3B中高表達(dá)；B:Western Blot檢測(cè)GATA4在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，GATA4在正常肝細(xì)胞(HL-7702)和肝癌細(xì)胞(HepG2、Hep3B和SMMC7721)中低表達(dá)。

圖1 mRNA水平在肝癌細(xì)胞(SMMC7721和Hep3B)中高表達(dá)，在蛋白質(zhì)水平在肝正常細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中低表達(dá)

2.2 轉(zhuǎn)錄因子GATA4抑制肝癌細(xì)胞增殖

體外構(gòu)建GATA4高表達(dá)模型，用載有GATA4 DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，用western blot 檢測(cè)GATA4表達(dá)，HepG2-GATA4細(xì)胞GATA4蛋白高表達(dá)(圖2A)。相反，在體外構(gòu)建GATA4沉默模型，用siRNA轉(zhuǎn)錄肝癌細(xì)胞Hep3B,用westetn blot 檢測(cè)干擾效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA#1和siRAN#2都成功干擾GATA4在肝癌細(xì)胞Hep3B中的表達(dá)(圖2B)。用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GATA4高表達(dá)細(xì)胞或低表達(dá)肝癌細(xì)胞增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GATA4高表達(dá)肝癌細(xì)胞(HepG2)增殖能力減弱，相反GATA4低表達(dá)肝癌細(xì)胞(Hep3B)增殖能力增強(qiáng)(圖2C)。這些結(jié)果表明GATA4抑制肝癌細(xì)胞(HepG2、Hep3B)增殖。

注：A：用載有目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，用western blot檢測(cè)GATA4蛋白質(zhì)表達(dá)；B:用siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞Hep3B，由western blot檢測(cè)GATA4蛋白表達(dá)；C：用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GATA4高表達(dá)或低表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。

圖2 GATA4抑制肝癌細(xì)胞的增殖

2.3 GATA4抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲

如前所述，體外分別構(gòu)建GATA4高表達(dá)或沉默模型。用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GATA4高表達(dá)或低表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響。結(jié)果表明，GATA4高表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞(HepG2)遷移，低表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞(Hep3B)遷移(P<0.05)(圖3A)。GATA4高表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞(HepG2)侵襲，低表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞(Hep3B)侵襲(P<0.05)(圖3B)。這些結(jié)果表明，上調(diào)GATA4表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞(HepG2、Hep3B)遷移和侵襲，相反，下調(diào)GATA4表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞(HepG2、Hep3B)遷移和侵襲。

3 討論

肝癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為肝炎病毒感染(以乙肝病毒、丙肝病毒為主)、黃曲霉素、酒精、亞硝胺類物質(zhì)、肝硬化等均可導(dǎo)致肝癌發(fā)生[3]。近年來，眾多學(xué)者從基因及蛋白質(zhì)層面對(duì)肝癌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)多種基因及其蛋白質(zhì)直接或間接參與了肝癌的發(fā)生和發(fā)展。

GATA4是含有440個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)，分子量約為50 kD，其在3個(gè)胚層的發(fā)育中均發(fā)揮作用,目前研究較多的是其在中胚層的作用。GATA4由于啟動(dòng)子甲基化[14]或核-漿轉(zhuǎn)運(yùn)異常導(dǎo)致的異位表達(dá)及其蛋白功能缺失[15,16]，在肺癌、消化道腫瘤和卵巢癌中很常見。并且研究還發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中GATA4 啟動(dòng)子的甲基化與幽門螺旋桿菌的感染有一定的聯(lián)系。Hellebrekers 等將GATA4的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入RKO 和HCT1116 細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GATA4過表達(dá)能明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，遷移[17]。Agnihotri 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)分級(jí)較高的多形性惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞存在著GATA4 的表達(dá)缺失，并且患者的生存期較短；并且GATA4 除了能在體外抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，在小鼠體內(nèi)也能抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與GATA4抑制細(xì)胞周期抑制性蛋白P21有關(guān)。此外，GATA4在早期乳腺發(fā)展中起重要作用[19]，并且在乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞系中GATA4的表達(dá)明顯降低[19]，GATA4的低表達(dá)水平預(yù)示著不良預(yù)后[19,20]。以上結(jié)果表明GATA4在大多數(shù)惡性腫瘤中低表達(dá)，并且在很多腫瘤發(fā)展過程中扮演著重要角色。

注：A：用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GATA4高表達(dá)或低表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的影響，GATA4高表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞遷移，低表達(dá)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞遷移；B：用transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GATA4高表達(dá)或低表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲性的影響，GATA4高表達(dá)抑制細(xì)胞侵襲，GATA4低表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞侵襲。*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。

圖3 GATA4抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲

然而，GATA4在肝癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)至今尚存在爭(zhēng)議，部分研究[10]表明GATA4在肝癌細(xì)胞系和組織中高表達(dá)，并且促進(jìn)正常肝細(xì)胞增殖，可能參與肝癌發(fā)生發(fā)展。另有部分研究證實(shí)GATA4在肝癌細(xì)胞系和組織中低表達(dá)[9,12,13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GATA4 mRNA在肝癌細(xì)胞系(Hep3B和SMMC7721)中高表達(dá)，在肝癌細(xì)胞系(HepG2)和正常肝細(xì)胞(HL-7702)中低表達(dá)，GATA4蛋白在肝癌細(xì)胞系(Hep3B、SMMC7721 和HepG2)和正常肝細(xì)胞(HL-7702)中均低表達(dá)，和李藝偉的研究[21]結(jié)果不盡相同，但是從蛋白水平兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，至于本研究為什么會(huì)出現(xiàn)GATA4mRNA高表達(dá)，而蛋白水平低表達(dá)可能有以下幾個(gè)原因：①本研究采用肝癌細(xì)胞株種類較少，不能代表總體趨勢(shì)，②GATA4只在轉(zhuǎn)錄水平參與肝癌細(xì)胞的調(diào)控，并未合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，具體機(jī)制還需后續(xù)進(jìn)一步研究。通過轉(zhuǎn)染建立體外高表達(dá)或沉默模型，發(fā)現(xiàn)上調(diào)GATA4表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞(HepG2、Hep3B)增殖、遷移和侵襲能力，相反，下調(diào)GATA4表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞(HepG2、Hep3B)增殖、遷移和侵襲能力，而肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力主要反應(yīng)腫瘤的轉(zhuǎn)移能力，因此，這些結(jié)果表明GATA4可能與肝癌的增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和GATA4在大部分腫瘤中的研究結(jié)果一致，因此，GATA4蛋白在肝癌細(xì)胞和組織中低表達(dá) ，可能與GATA4啟動(dòng)子高甲基化和核-漿轉(zhuǎn)錄異常相關(guān)。GATA4高表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞中增殖、遷移和侵襲與GATA4在結(jié)腸癌和腦膠質(zhì)瘤研究結(jié)果一致，可能與GATA4能誘導(dǎo)細(xì)胞周期抑制蛋白P21的表達(dá)相關(guān)，其具體機(jī)制還需后續(xù)進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，通過本研究我們證實(shí)，GATA4 mRAN在部分肝癌細(xì)胞(Hep3b、SMMC-7721)中高表達(dá)，其蛋白在肝癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞中均低表達(dá)，GATA4蛋白在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)可能與GATA4啟動(dòng)子高甲基化和核-漿轉(zhuǎn)錄異常導(dǎo)致其表達(dá)缺失有關(guān)。并發(fā)現(xiàn)GATA4表達(dá)上調(diào)能抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，這些抑制作用可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞周期抑制性蛋白P21的表達(dá)相關(guān)，但其具體機(jī)制需后續(xù)進(jìn)一步研究證實(shí)。