樹突狀細胞/肺癌細胞雜交疫苗特異性抗肺癌免疫作用研究

劉 銳，劉 蕾，趙麗純，劉子維，高媛媛，白 冰

(1.吉林大學中日聯誼醫院 a內分泌科;b醫務部;c感染管理部,吉林 長春130033；2.吉林大學藥學院 生物工程教研室)

樹突狀細胞(DC)被確定為最有效的抗原遞呈細胞(APC)，操縱和刺激免疫系統的關鍵組成部分。DC通過促進腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞(CLT)和輔助性T細胞(Th細胞)的產生和增殖，在誘導保護性和治療性抗腫瘤免疫中發揮著關鍵作用[1]。研究者已經報道過許多腫瘤抗原(Ag)負載DC誘導高效抗腫瘤免疫反應，在小鼠腫瘤模型和腫瘤患者試驗中均有[2]。最佳治療參數包括DC來源、DC成熟、抗原選擇(Ags)、Ag載體方法、注射部位、劑量和適當的抗腫瘤免疫監測，這些方法的療效需進一步提高。治療參數包括DC來源、DC成熟、抗原選擇(Ags)、Ag載體方法、注射部位、劑量和適當的抗腫瘤免疫監測，這些方法的療效需進一步提高，因此以其為基礎設計的腫瘤疫苗日益受到重視[3,4]。然而，目前樹突狀細胞/腫瘤細胞雜交疫苗在肺癌中的功能及其免疫機制少見報道，因此本項研究探索其特異性抗肺癌免疫作用，可以為惡性腫瘤的治療和判斷預后提供新的參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

骨髓：共10例,骨髓病理檢查診斷骨髓內均無癌灶，無病理骨髓象。獲自吉林大學第三臨床醫院胸外科肺癌患者手術中切下的肋骨；肺癌組織標本：共10例，取自上述患者手術中切下的腫瘤樣本，均經病理檢查確診為肺癌，保存于液氮中。外周血：上述10例患者的外周血。患者術前未接受放療、化療，均簽署知情同意書。本研究經吉林大學第三臨床醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑和儀器

試劑：RPMI-1640培養基，L-谷氨酰胺青霉素、鏈霉素，新生胎牛血清，FITC標記抗CD86，抗組織相容性抗原-DR抗體，抗CA-199單克隆抗體，淋巴細胞分離液， 重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)，重組人腫瘤壞死因子-α(rhTNF-α)，重組人白介素- 4(rhIL-4)，聚乙二醇-4000(PEG-4000)，氚-胸腺嘧啶核苷，絲裂霉素胰蛋白酶。

主要儀器設備：二氧化碳孵箱(日本)，倒置顯微鏡(日本)，生物安全柜(國產)，-80℃低溫冰箱(日本)，超速離心機(國產)，酶標儀(美國)，流式細胞儀(美國)，γ照射源(法國)。

1.3 主要方法

1.3.1從肋骨髓中提取骨髓全血細胞 體外誘導：無菌操作下，取肋骨，用PBS沖洗，再用骨鉗切成4 cm左右長，在一側用已吸取RPMI-1640培養基的注射器，清洗骨髓腔，沖洗多次后，100 mm尼龍細胞過濾器過濾，淋巴細胞分離液(70%)分離單核細胞。獲得的單含細胞配置成 1×106cells/ml 濃度，被添加到含RPMI 1640完全培養基的24孔培養皿中，并補充補10 ng/ml rhGM-CSF及20 ng/ml rhIL-4以誘導單核細胞在體外分化成DC，在37℃,5% CO2，加濕的培養箱中孵育。

1.3.2DC表型檢測 抗體CD86、HLA-DR作免疫熒光染色及流式細胞熒光分選技術分析培養9天的DC。

1.3.3癌細胞培養 液氮中取出10例肺癌樣本，無菌剪碎，用0.25%胰蛋白酶消化組織5 h后，收集單個細胞，PBS沖洗，培養于RPMI 1640完全培養基中；通過組織學染色觀察腫瘤細胞形態。

1.3.4DC與肺癌細胞雜交及鑒定 DC與肺癌原代細胞通過50%PEC-4000融合雜交，DC與癌細胞的比例為2:1，融合細胞培養在含20%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基中,培養體系中加入 GM-CSF(4 ng/ml)。測定CD86、HLA-DR表達水平，FICT-抗HLA-DR、CD86抗體標記DC。取一株DC/腫瘤細胞融合細胞、且CA199陽性表達的細胞，以FICT-抗CD86和PE-抗CA199進行雙標記，同時以腫瘤細胞和DC作為對照組，檢測DC/腫瘤細胞雜交體的免疫反應。

1.3.5CTL產生及測量其活性 分組如下：DC單獨(1.5×106/鼠)、腫瘤細胞單獨(4×105/鼠)、DC與腫瘤細胞同時加入、抗原肽刺激DC、DC/腫瘤細胞融合瘤苗后，以20 000 rad劑量照射上述細胞后，與同源外周血單核細胞共同培養3天，再與肺癌細胞共同培養5天，摻入3H-TdR 20 h后，收集細胞，測定放射性核素閃爍記數值。

2 結果

2.1 DC的產生

我們以骨髓前體細胞為原料制備DC。鏡下觀察，在培養的前5天，并沒有明顯的細胞集聚體出現，而在含有GM-CSF和IL-4的培養基中培養4天，樹突狀細胞集聚體出現，收貨典型的成熟DC，見圖1。

2.2 人骨髓DC及融合細胞的表型特征

體外誘導的人骨髓來源DC表達高水平表達HLA-DR、CD86。對照組DC和腫瘤細胞表達一種相應抗原，而雜交體同時高表達兩種抗原，見圖2、圖3。

圖1 人骨髓來源的DC的形態學觀察(200×)

圖2 人骨髓來源的DC表型特征

圖3 骨髓來源的DC/腫瘤融合細胞的表型特征

2.3 原代培養肺癌細胞的形態結構特征

如圖4所示，6例原代培養肺癌細胞均呈上皮型，細胞形態多樣，多呈多角型，核：漿比例增加，核深染。

圖4 原代培養肺癌細胞(瑞氏染色)

2.4 DC/肺癌雜交體對CTL的誘導

見表1。在體外，DC/肺癌細胞雜交疫苗能有效誘導CTL產生，后者對靶細胞產生顯著的殺傷效力；以抗原肽刺激DC、DC/肺癌細胞雜交體同時加入誘導CTL的培養體系，均可誘導出CTL活性，但是抗原肽刺激DC對靶細胞的細胞毒效力明顯低于雜交瘤苗。

表1 人DC融合疫苗的體外誘導殺傷作用

注：**第4組、第5組分別與前3組比較；***第6組與前3組比較；*第6組與第4、第5組比較

3 討論

應用癌癥免疫療法治療癌癥患者是一個很有前景的臨床研究領域。DC作為一種專業的抗原呈遞細胞(APCs)，在誘導抗腫瘤免疫反應中發揮著重要作用。因此，基于DC的癌癥免疫治療成為研究的熱點[5,6]。以腫瘤細胞基因轉染DC、腫瘤裂解物的脈沖DC、腫瘤抗原致敏等,是目前主要的疫苗制作方發。但這些方法具有免疫應達應有限、半衰期短、組織相容性復合體(MHC)分子的已知抗原多肽數量有限等缺點；因此，開發新的腫瘤治療方法收到廣泛關注。目前正在研究一種利用通過化學、電、物理手段或病毒產生的使DC和整個腫瘤細胞生成雜交融合細胞。與上述方法相比，融合方法為抗原肽的表達和隨后誘導抗腫瘤免疫反應提供了若干優勢。DC-腫瘤融合細胞可以避免識別單個腫瘤相關抗原(TAA)的艱巨任務。此外，DC-腫瘤融合細胞可呈遞多種TAA，包括未鑒定的分子，從而增加響應抗原特異性T細胞的頻率和使抗腫瘤免疫力最大化。重要的是，DC-腫瘤融合細胞可以在豐富的共刺激分子的情況下通過MHC Ⅰ類和Ⅱ類分子呈遞抗原肽，從而同時激活多克隆抗原特異性CD4+和CD8+T細胞，提供T細胞幫助并避免誘導耐受。DCs以及腫瘤細胞被獨立修飾，而它們的特征在融合后持續存在。

許多動物研究表明，DC-腫瘤融合細胞疫苗不僅可以提供針對腫瘤細胞攻擊的保護作用，還可以消退已建立的腫瘤，包括結腸直腸癌，食道癌，胰腺癌，肝細胞癌，乳腺癌，喉癌，腎細胞癌，肉瘤，肥大細胞瘤，黑素瘤，神經母細胞瘤和骨髓瘤[7,8]。目前，樹突狀細胞/腫瘤細胞雜交疫苗在肺癌中的功能及其免疫機制未見報道。此外，許多佐劑包括白細胞介素-2(IL-2)，IL-12，IL-18，Toll樣受體(TLR)和合成的CpG寡脫氧核苷酸(ODN)已被用于增強抗腫瘤免疫力[9]。

本研究結果表明，在體外DC/肺癌細胞雜交體能夠有效刺激T淋巴細胞，并誘導有效的抗腫瘤T細胞應答。其淋巴細胞毒性顯著高于以抗原肽刺激DC所誘導產生。因此，DC/肺癌細胞雜交體可能對治療肺癌有價值。但是，當DC-腫瘤融合細胞疫苗用作癌癥免疫療法時，佐劑對于誘導抗腫瘤免疫是必需的，從而為癌癥患者提供強大的臨床益處。

盡管本實驗DC雜交瘤苗對肺癌細胞的治療效果的研究取得一定進展,未來仍需要動物實驗和體內深入驗證，并進一步探索DC雜技瘤苗抗肺癌免疫應答及其機制。由于 DC與腫瘤細胞雜交體后遞呈的抗原較為復雜,應用于機體可能引起人體面的其他變異，因此在未來的實驗中需對融合方法的安全性、臨床局限性、抗腫瘤干細胞反應的程度、副作用等方面進一步探索。