AI化的腫瘤液體活檢研究進展

馬舒婷,金 玲，謝 風

(吉林大學中日聯誼醫院 檢驗科，吉林 長春130033)

人工智能(AI)是一個基于計算機科學的類別，旨在模擬人類思維的過程、學習的能力以及知識的存儲[1]。因其與醫療健康領域的融合不斷加深，醫療領域的應用越來越廣泛，辟如在藥物的開發、醫學影像的識別、智能健康管理和輔助診斷等方面。當下，腫瘤的研究和治療正進入精準化和個體化時代，這便要依托于更好的診斷標志物和檢測方法，達到提高疾病的診斷、治療以及預測能力。在盡可能早的階段檢測出體內癌變，能夠顯著提高患者的治愈率和長期存活率。因液體活檢具有可連續取樣、自動化以及結果可重復等優勢，使其得到了飛速的發展[2]。液體活檢與人工智能領域能夠深度融合與發展，將為臨床應用帶來更加廣泛而深入的價值。

1 液體活檢

1.1 概述

液體活檢，是一種檢測人體液中具有腫瘤特異性或基因特征的信息，進而對體內的腫瘤相關狀態進行監測的方法。當前，組織活檢被認為是癌癥診斷中的金標準，但其在組織選取等多方面具有局限性，操作過程中會有增加轉移的風險[3]，相比于傳統的組織活檢，液體活檢檢測方法快速、簡潔，擁有微創、可重復、動態檢測病情變化等特點。 2019 年 NCCN NSCLC指南(V1版)建議優先進行血液基因檢測的，同時提出無組織標本時可用液體活檢代替，表明液體活檢的應用價值。液體活檢不但包括循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)、循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、循環腫瘤RNA(circulating RNA,ctRNA)、外泌體(extracellular vesicles,EVs)，而且也包括尿液、胸腔積液等細胞外液體的某些物質。

1.2 主要液體活檢檢測原理及方法

1.2.1CTCs CTCs通常是指來自腫瘤的原發性或轉移性病變的癌細胞，分別為血液中的單個腫瘤細胞或幾個腫瘤細胞[4]。它進入血液循環主要通過參與上皮-間質轉化(EMT)[5]，使腫瘤細胞具有侵襲和遷移能力，是腫瘤血行轉移的主要機制[6]。CTCs富集和分離的基本原理通常依據它們的物理性質(密度梯度離心法，過濾法等)、特異性免疫識別(免疫磁珠細胞分選)、與捕獲表面的親和力[7,8]。CTCs檢測技術主要基于抗原抗體的特異性結合原理，采用各種流式細胞儀、免疫細胞化學、RT-PCR、Cell Search系統、CTCs芯片、激光掃描技術、熒光原位雜交、多肽納米磁珠等方法，用于特定分子標志物計數或分型[9,10]。目前，CellSearch是已通過FDA認證的CTCs檢測系統，具有較少干擾因素，更好的穩定性和更高的自動化程度，同時可處理多個樣本[11]。也可將免疫熒光標記技術與免疫磁珠技術結合，將偶聯至磁珠上的上皮細胞黏附分子抗體(EpCAM)與腫瘤細胞的表面抗原結合，用熒光標記細胞核從而實現對CTCs的富集，是目前臨床上應用最廣泛的方法[12]。

1.2.2ctDNA ctDNA是存在于血液中的單鏈或雙鏈DNA，由腫瘤細胞的凋亡而剝落并且攜帶與腫瘤突變的相關表觀遺傳變化。ctDNA的檢測有定性和定量方法，主要通過檢測ctDNA的突變基因(Sanger測序、基因芯片、二代測序、BEAMing技術、CAPP-Seq技術、數字PCR等)和ctDNA甲基化(高效液相色譜法，甲基化特異性PCR，甲基化間位點擴增等)。BEAMing法已應用于臨床試驗，其敏感度較高，可檢測到比例<1:10000的突變[13]。CAPP-Seq法通過結合RNA探針捕獲技術和二代測序檢測基因組的突變，從而改善測序深度，有效檢出由ALK與ROS1融合的各種基因突變[14]。

1.2.3外泌體 腫瘤外泌體是納米級的雙層脂質膜結構的包裹體，直徑為30-100 nm，可攜帶細胞特征性生物信息(蛋白質、脂質、DNA、mRNA、microRNA、Non-coding RNA等)[15]，廣泛存在于各種體液中，包括血液、尿液、唾液、腦脊液、乳汁等[16]。EVs的釋放主要通過向內凹陷形成多囊泡胞內體(multivesicular bodies,MVBs) 和向外出芽形成微泡(microvesicles,MVs)。其作為一種分泌微囊泡具有細胞間信息傳遞的功能，參與細胞遷移和通訊、免疫反應、血管新生和腫瘤細胞的生長等多種生物學行為[17]。研究表明，癌細胞比正常細胞分泌更多的外泌體，由此可獲得腫瘤細胞的相關信息[18]。也有相關報道稱細胞釋放的 miRNA 主要存在于囊泡之中，作為一種分泌分子進而影響受體細胞表型[19,20]，或與特定的細胞表面受體結合，從而對靶細胞進行調控。現可采用離心法、色譜法以及免疫磁珠法進行分離，對于鑒定可以用電鏡直接觀察其形態；可依據其表面的標志物CD9及CD63等跨膜分子作為抗體與相應的抗原結合，應用 Western blot 法測其蛋白表達量；還可以使用動態光散射(DLS)、流式細胞儀(FCM)和納米顆粒跟蹤分析；PCR法和測序法被廣泛應用。

1.3 液體活檢在腫瘤中的應用

液體活檢可應用于腫瘤的早期篩查和診斷、轉移和進展、耐藥性、預后評估、監測復發、微小病灶的殘留、腫瘤的異質性進化以及建立基因表達譜等領域擁有技術優勢和廣泛的臨床應用價值[21-24]。同時，液體活檢可對腫瘤細胞進行動態監控，相比于一般組織活檢可以更加全面地掌握疾病的實時情況以及變化過程。目前蛋白質已在臨床工作中用作診斷和監測療效的生物標志物，但其易出現假陽性的結果，有研究表明ctDNA的檢測相比于蛋白質類出現假陽性的概率要低，ctDNA能反應腫瘤組織中的基因突變譜和頻率，可作為療效評價和治療后隨訪的監測指標[25]。據報道，ctDNA檢測是對TNM分期的補充，建議用TNMB分期替換TNM分期，添加的一個“B”即是液體活檢相關信息，基于此分期系統，可以獲得預后和療效信息[26]。美國加州大學一研究組織[27]通過測定ctDNA的甲基化狀態，可以確定腫瘤的起源。也可用于一些原發灶不明的癌癥，判斷其腫瘤發生的部位以及復發風險等。

隨著精準和個體化醫學的發展以及大數據的應用，基因信息監測已成為人們關注的焦點。然而，目前液體活檢技術只能在一定程度上檢測到腫瘤信息。由于部分腫瘤細胞具有細胞轉化的能力，在其活動過程中會發生變形，部分腫瘤細胞比正常細胞小，在篩選腫瘤細胞的過程中很難有效地篩選出血液中的所有腫瘤細胞。因此，需要進一步提高腫瘤細胞的捕獲技術。循環腫瘤DNA在血液里的含量也比較少，只能檢測出極少部分。基于人工智能的液體活檢可以很大程度上解決此類問題。

2 AI化的腫瘤液體活檢

如今，大多數液體活檢研究集中在晚期和轉移性腫瘤患者身上，這些患者的血液釋放的腫瘤細胞和核苷酸比早期癌癥多，因此更容易檢測到腫瘤。而一些研究者將目光投向于人工智能，開發可以幫助我們解讀血中微弱信號的機器學習算法，進而對早期癌癥的識別和療效判斷等方面得到幫助。人工智能網絡如同人腦中的神經元，通過神經網絡或者數以千計的連接點解釋所得的數據。同時，隨著數據的輸入，機器學習算法可以自我完善和學習，以提高其診斷靈敏度。人工智能給液體活檢的早期診斷和篩查提供了新的技術支持。

2.1 Freenome

Freenome的人工智能基因組學平臺能夠對多種物質進行分析和測序，利用人工智能的深度學習，分析基因組、蛋白質以及表觀遺傳學上的變化規律。該平臺整合復雜的數據集，找出傳統檢測手段無法發現的一些隱匿性關聯，從而達到對疾病的診斷和預測目的。Freenome檢測血液樣本中循環游離DNA(cfDNA)，當人體免疫系統對癌細胞發起攻擊時，便會產生這種DNA碎片進入血液，利用AI分析大量的血液樣本，從而在復雜的免疫信號與疾病間建立起關聯性，利用深度學習的經驗也可判斷是否患癌以及腫瘤發生的部位。它針對健康人和腫瘤患者進行WGS(全基因測序)，利用基因組學和算法融合的優勢，將所得數據記錄到AGE(Adaptive Genomics Engine)，其分析的樣本越多，辨別非癌癥組與癌癥組的能力越強，越能達到精準分類的目標。

2.2 GRAIL

Grail旨在在無癥狀腫瘤患者血液中發現其DNA，并對腫瘤進行早期篩查和診斷。為此，Grail啟動了循環游離基因組圖譜研究(Circulating Cell-free Genome Atlas,CCGA)臨床實驗項目。在ESMO(歐洲腫瘤內科學會)年會上，Grail公布了CCGA的最新相關數據，表明血液活檢不僅可以用于早期篩查，而且對不同類型的腫瘤也有特異性。CCGA的第一個子研究原型測序方法包括：針對cfDNA和白細胞進行靶向配對測序，以檢測單核苷酸變異、小片段的插入和(或)缺失突變；對cfDNA和白細胞進行WGS，以檢測拷貝數目的變化；通過檢測cfDNA甲基化的異常，從而達到cfDNA全基因組的亞硫酸氫鹽測序。他們將大量的數據集輸入到生物信息和機器學習算法中，以區分真正的癌癥信號和大量的背景生物噪聲。下一步他們還會繼續優化測試系統，進而在CCGA更大的數據集中驗證，隨著樣本量的增加，有望提高其測試性能。

2.3 FoundationOne

FoundationOne是一種癌基因檢測技術，包括FoundationOne CDx、FoundationOne Heme和FoundationOne Liquid。FoundationOne CDx 是FDA批準的首個伴隨診斷(Companion Diagnostics,CDx)，可對實體腫瘤進行臨床分析驗證，已獲美國批準用于腫瘤個體化醫療。其基于二代測序，可給出基因組信號報告，包括微衛星不穩定性(MSI)和腫瘤突變負荷(tumor mutational burden,TMB)[28]。FoundationOne Liquid是基于下一代測序的混合捕獲體外診斷裝置。它能檢測血液中置換、插入和刪除的變化、拷貝數的變化和循環無細胞DNA選擇性基因重排。FoundationOne Liquid 分析了70個包括同源重組缺陷(HRD)基因的已知能夠促腫瘤細胞生長的基因，并給出了MSI的基因組生物標志物，可幫助后續的免疫和靶向治療等。

2.4 Guardant360

Guardant希望利用基因組測序為患者做出診斷，并確定最佳治療方案。Guardant360檢測是通過發現血液循環中的ctDNA，通過這種微創的方式獲得腫瘤相關信息，不僅可以提高診斷效率，而且可以降低診斷成本[29]。Guardant 360有73個基因經過CLIA的認證，其中包括G7生物標記物(7項指南推薦預測標記物：EGFR、ALK、ROS1、BRAF、RET、MET、ERBB2)和KRAS預后標記物。前不久公布的該產品在非小細胞肺癌(NSCLC)患者中進行基因變異臨床試驗，結果表明，其檢測結果的靈敏度與傳統的組織活檢相似。Guardant360發現所檢測的ALK,BRAF，EGFR以及ROS1基因改變的所有陽性結果都被織活檢確認了。

3 展望

腫瘤仍然是困擾著人類的一大難題，傳統的組織活檢雖然是臨床診斷上的金標準，但也有其局限性。而液體活檢具有非侵入性、可實時動態檢測以及可重復性等優勢，在腫瘤的早期診斷、個體化醫療以及預后判斷等方面有著不可替代的價值。但因液體活檢中的所檢測的物質在血中含量不是很高，傳統檢測方法靈敏性無法完全滿足，AI等技術的加入為該領域的發展帶來了新的生命和希望。

隨著液體活檢技術的廣泛開發與應用，使得液體活檢數據量不斷增加，大數據與人工智能技術在該領域得以發展與融合，AI化的液體活檢使得資源更好地得到整合，信息得到互補，挖掘潛在的信息和模式。加之其具有深入和自主學習等特點，隨著進程的不斷發展，敏感性以及準確性會得到極大提升。人們因此對腫瘤的發生發展機制得以進一步深入研究，在推動促進精準醫學發展上起到積極而重要的意義。現有大多數檢測多關注于單一分析物質，不過在AI的幫助下，液體活檢也將會進入多參數分析時代。當然，這些都要建立在臨床有效性得到進一步證實之后，AI引導下的液體活檢才會對腫瘤患者的臨床管理上發揮其更為廣泛和有效的潛力。