植酸酶對中華絨螯蟹幼蟹生長、消化性能及物質利用率的影響

楊 璐 韓鳳祿 戚常樂 郭建林 盧建挺 徐 暢 劉 爽黃志鵬 王曉丹 陳立僑

(1. 華東師范大學生命科學學院, 水生動物營養與水環境健康實驗室, 上海 200241; 2. 浙江省淡水水產研究所, 湖州 313001)

豆粕、棉粕、菜粕等植物蛋白源價格低廉, 產量高, 將其添加到水產配合飼料中替代魚粉已漸成研究熱點和飼料開發的趨勢[1]。然而, 植物原料中存在的抗營養因子如植酸等, 會對動物體的攝食、生長和養殖環境產生不利影響。植酸, 又被稱為肌醇六磷酸, 是植物蛋白原料中一種常見的熱穩定性抗營養因子, 它是陽離子和高能磷酸基的儲存體,是植物種子和谷物在成熟過程中自然形成的化合物[2]。植酸在豆粕、菜粕中含量達到1%—5%[3,4],當在飼料中添加高比例植物蛋白源時, 其負面影響就會顯露出來[5]。對羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)[6]、草魚(Ctenopharyngodon idellus)[7]、大西洋鮭(Salmo salarL.)[8]等動物的研究證實, 飼料中的植酸會降低消化酶活性, 降低生長性能; 此外, 一些水產動物如魚類及甲殼類等, 其消化道不能分泌植酸酶[9], 故對于含有植酸的飼料不能進行有效的分解[10], 大部分植酸最終排入水體, 除造成礦物質元素的浪費, 甚至還將污染養殖環境。已有研究表明, 植酸的抗營養作用是植物性原料替代魚粉有待解決的問題之一[11]。植酸酶, 一種廣泛存在于自然界中的細胞外酶[12], 作為一種磷酸酶它能夠專一性的對植酸進行逐級分解, 可消除植酸的負面作用[13]。在斑節對蝦(Penaeus monodon)[14]的研究中發現, 外源補充植酸酶分解了植酸蛋白化合物,改善蝦體的生長性能、提高對蛋白質的消化利用率。同樣的, 在真鯛(Pagrus major)[15]飼料中添加2000 U/kg的植酸酶能夠顯著降低磷排泄, 經濟效益和生態效益著。植酸酶對植酸的改善作用是近年來水產動物營養的一個研究熱點。

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis), 俗稱河蟹, 是我國淡水蟹養殖中產量最高的經濟物種。隨著中華絨螯蟹配合飼料開發和應用比例的提高, 飼料中植物蛋白原料占比也越來越重[16], 有效提高植物原料的替代比例, 提高飼料效率, 能夠給中華絨螯蟹養殖帶來很多更多的經濟效益。植酸酶作為一種飼料添加劑所開展的營養研究已成為熱點, 但目前有關植酸酶在中華絨螯蟹飼料中的研究還未見報道。本研究參考Nicolasa等[3], 在飼料中添加10 g/kg植酸鈉, 并通過在飼料中添加不同濃度的植酸酶,探討其對幼蟹作用特點, 觀察其在幼蟹的生長、消化性能及營養物質利用方面產生的影響, 從而確定植酸酶的適宜添加量, 結果為今后中華絨螯蟹飼料配方的制定提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 飼料制作

本實驗依據中華絨螯蟹營養需求, 以魚粉、酪蛋白和明膠為主要蛋白源, 魚油和豆油為脂肪源,不含植酸和植酸酶的組別作為對照組(C), 處理組在含有10 g/kg植酸的基礎上, 添加0、500、1000、1500和2000 U/kg的植酸酶, 分別命名為P0、P500、P1000、P1500和P2000。實驗飼料配方組成和化學分析見表 1。在所有飼料原料混勻后, 使用F-26雙螺桿擠條機(華東理工大學科技實業總廠, 中國)加工成直徑為1 mm的條狀飼料, 期間監測螺桿最高溫度不高于55℃, 保證溫度不會影響植酸酶活力。在室溫下風干后, 同樣利用擠條機將飼料破碎,使用10目、16目及26目篩子, 將飼料分成不同規格的顆粒, 用自封袋分裝好, 每組做好標簽并儲存于-20℃冰箱保存備用。

1.2 實驗動物與飼養管理

養殖試驗在浙江省淡水水產研究所八里店綜合試驗基地進行。幼蟹購自上海崇明島, 暫養結束后, 將720只附肢完整、健康的幼蟹(4.34±0.05) g隨機分入24個水族桶, 水族桶直徑1 m, 水深45 cm。共6組, 每組設置4個重復, 每桶30只幼蟹。每個桶中放入6片瓦片及6個由無毒無味的塑料管捆成的躲避物, 供幼蟹藏匿, 以避免相互殘殺。每天在6:30、16:30和21:30飽食投喂, 根據幼蟹的攝食情況及時調整投喂量, 確保殘餌較少。投喂2h后吸出殘餌并烘干、稱重、記錄, 并根據蟹體大小適當調整投喂飼料的顆粒規格。在實驗過程中每天換水量占總水體1/3, 水溫維持在(24±2)℃, 溶解氧＞7.0 mg/L, 總氨氮＜0.2 mg/L。養殖過程中若發現死蟹, 及時撈出并記錄日期、重量。養殖試驗為期8周。

1.3 樣品處理

在8周養殖結束后, 饑餓處理24h后取樣。每桶取5只幼蟹用于體組成生化分析, 其余的置于冰上麻醉, 采集肝胰腺、腸道凍存于-80℃冰箱待檢。

1.4 消化率實驗

消化率試驗采用體外消化, 具體參照Huang等[17]和Liu等[18]的方法。將幼蟹置于冰上, 取其胃、肝胰腺和腸道, 清除腸道內容物后稱量總消化道重量。加入10倍體積預冷生理鹽水(4℃, 0.9%), 用電動勻漿機在冰浴條件下勻漿。4℃, 5000 r/min離心10min, 丟棄上層脂質取上清液作為粗酶液, -80℃凍存, 備用。每個處理設置3個平行。將1 g飼料與2.5 mL粗酶液加入透析袋中扎好, 放入100 mL帶塞錐形瓶中, 再加入47.5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液, 置于37℃的恒溫水浴振蕩器中, 以50 r/min進行離體酶解消化8h。每個樣品3個平行, 每個處理重復2次。

1.5 生化分析

取適宜大小的肝胰腺、腸道組織塊, 按1:9(m:v)的比例加入預冷的生理鹽水, 制成10%勻漿液,2500 r/min 離心10min, 取上清液待測。胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及總蛋白含量試劑盒購自南京建成生物工程研究所, 按具體說明進行檢測。其中,胰蛋白酶: N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)測定法。一個活力單位定義為在pH 8.0, 37℃條件下, 每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.003; 淀粉酶: 淀粉-碘顯色法。一個活力單位定義為每毫克蛋白在37℃與底物作用30min, 水解10 mg淀粉。脂肪酶: 化學比濁法。酶活力定義: 在37℃條件下, 每毫克蛋白在反應體系中與底物反應1min, 每消耗1 μmol底物為一個酶活力單位。總蛋白含量: 考馬斯亮蘭法, 單位為mg/mL。

全蟹的常規體組生化成分的分析參考 AOAC(1995)的標準方法。水分測定采用 105℃烘干至恒重法, 粗蛋白含量測定采用凱氏定氮法(FOSS,Kjeltec2200, Denmark), 粗脂肪測定采用氯仿甲醇法(CM法), 灰分測定采用馬弗爐550℃灼燒恒重稱量法, 總磷采用鉬黃分光光度法, 植酸磷含量測定采用三氯乙酸法(TCA法)。

1.6 生長、消化性能測定

各指標計算公式如下:

其中N0和Nt分別為實驗開始和結束時蟹的個數;W0和Wt分別為幼蟹初始和終末重量(g);W為蟹體總增重(g);IF為試驗期間總攝食飼料干重(g);IN為試驗期間總攝食飼料蛋白質質量(g); d為試驗天數;Ni/Nf為蟹體初始/最終某營養成分含量(%);Nd為飼料某營養成分含量(%);m為飼料樣品質量(mg);m1為濾渣質量(mg);Lp為濾渣粗蛋白含量(%);m2為透析液中可透析磷/鈣質量(mg)。

表1 飼料配方及成分分析(風干基礎, %)Tab. 1 Diet formulation and analyzed chemical composition (air dry basis, %)

1.7 數據分析

實驗數據均以平均值±標準誤(Mean±SE)表示,先用SPSS19.0進行單因素方差(One-way ANOVA)分析, 若存在顯著差異(P＜0.05), 則采用Duncan法進行多重比較。

2 結果

2.1 植酸酶對中華絨螯蟹幼蟹生長和飼料利用的影響

如表 2所示, 幼蟹的初始體重無顯著性差異(P＞0.05)。隨著飼料中植酸酶含量的增加, 幼蟹終末體重、增重率、特定生長率逐漸升高, P2000顯著高于P0 (P＜0.05), 對照組與各處理組無顯著差異(P＞0.05); 各處理組蛋白質效率都高于P0, P2000及對照組顯著高于P0 (P＜0.05); 飼料系數方面則是P0顯著高于P2000 (P＜0.05), 其余組之間無顯著差異(P＞0.05); 各實驗組之間的存活率、攝食量等無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 植酸酶對中華絨螯蟹體成分的影響

如表 3所示, 隨著植酸酶含量增加, 全蟹體磷含量逐漸升高, 其中P1500及P2000顯著高于P0(P＜0.05), 其余各處理組之間沒有出現顯著性的差別(P＞0.05); 各實驗組在水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分及鈣含量方面無顯著性差異(P＞0.05)。

2.3 植酸酶對中華絨螯蟹消化道消化酶的影響

在肝胰腺中, P0胰蛋白酶活力與P500差異不顯著(P＞0.05), 但顯著低于其他各組(P＜0.05); 淀粉酶活力則是P2000顯著高于其他各組(P＜0.05); 脂肪酶活力各實驗之間差異性不顯著(P＞0.05)。在腸道中, P2000胰蛋白酶活力與對照組差異不顯著, 但顯著高于其他各組(P＜0.05); 脂肪酶和淀粉酶活力各實驗組之間差異性不顯著(P＞0.05, 表 4)。

2.4 植酸酶對中華絨螯蟹幼蟹體外消化率的影響

各實驗組在干物質消化率及鈣透析率方面差異性不顯著(P＞0.05); 蛋白質消化率隨植酸酶含量的升高而逐漸升高, P2000顯著高于P0 (P＜0.05), 但與對照組沒有顯著性差異(P＞0.05); 磷透析率有同樣的升高趨勢, 在P1000、P1500及P2000顯著性地高于P0 (P＜0.05), P2000顯著性高于對照組(P＜0.05,表 5)。

2.5 氮磷保留率

結果顯示, 各實驗組幼蟹對氮、磷攝入量差異不顯著(P＞0.05); 與P0相比, 添加植酸酶提高了幼蟹氮、磷保留率。P2000氮保留率顯著高于各處理組(P＜0.05); P2000磷保留率顯著高于P0組(P＜0.05),與其余組沒有顯著的差異(P＞0.05, 表 6)。

表2 植酸酶對中華絨螯蟹幼蟹生長性能的影響Tab. 2 Effects of phytase on the growth performance of the juvenile crab Eriocheir sinensis

3 討論

已有研究表明, 植物蛋白源能否有效替代優質的魚粉, 前提是要先消除其抗營養因子的不利影響。然而, 熱穩定性抗營養因子采用常規方法往往難以去除, 例如植酸等。已有研究證實, 由于其特有的螯合性質, 配合飼料中的植酸會降低動物體對飼料的消化利用率和物質保留率, 從而抑制機體的生長速度[19]。飼料中植酸含量超過13 g/kg時, 日本牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼魚的攝食量和增重率都會顯著降低[20]。本實驗發現10 g/kg植酸對中華絨螯蟹生長有抑制作用, 并會降低蛋白質效率,導致飼料系數升高, 植酸對幼蟹的負面效應突顯。而這種阻抑作用可隨著植酸酶添加而得到緩解, 表現為幼蟹的生長性能逐漸得到改善和提高, 當植酸酶含量添加到2000 U/kg時, 中華絨螯蟹的增重率、特定生長率都有顯著的提高。與本研究相似, 當凡納濱對蝦攝食2000 FTU/kg植酸酶預處理的大豆粉時, 增重率可達到不添加植酸酶的1.39倍[21], 表明元飼料中添加適量植酸酶有利于提高蝦、蟹類甲殼動物的生長性能。究其原因, 植酸酶能夠有效地作用于植酸, 使植酸逐步去磷酸化生成一系列低肌醇磷酸酯, 并最終產生自由肌醇與無機磷的過程[22],由此消除植酸對礦質磷及其他營養物質的螯合作用, 這無疑有利于甲殼動物對鈣、磷等礦物元素的吸收利用。實驗同時發現, 在添加合理劑量的植酸酶后, 中華絨螯蟹的飼料系數顯著降低, 同時蛋白質效率顯著提高。在大西洋鮭[23]的實驗中也發現同樣結果, 加入植酸酶后飼料系數從0.84降低至0.75。飼料系數、蛋白質效率是衡量水產動物對飼料利用效率的重要依據[24], 由此可見, 添加植酸酶提高了飼料的利用率, 促進了機體的物質積累, 有效改善了生長性能。

表3 植酸酶對中華絨螯蟹幼蟹全蟹體成分的影響Tab. 3 Effects of phytase on the composition of whole crabs of the juvenile crab Eriocheir sinensis (%)

表4 植酸酶對中華絨螯蟹幼蟹消化酶活力的影響Tab. 4 Effects of phytase on digestive enzymes of the juvenile crab Eriocheir sinensis (U/g prot)

表5 植酸酶對中華絨螯蟹幼蟹體外消化率的影響 (%)Tab. 5 Effects of phytase on the in vitro digestibility of the juvenile crab Eriocheir sinensis (%)

表6 植酸酶對中華絨螯蟹幼蟹氮磷保留的影響Tab. 6 Effects of phytase on nitrogen and phosphorus retention of the juvenile crab Eriocheir sinensis

中華絨螯蟹是一種雜食偏肉食性動物, 在其分泌的消化酶中, 胰蛋白酶完成大部分蛋白質的水解作用, 起到主要的消化功能, 淀粉酶、脂肪酶活性略低[25]。飼料中的植酸會顯著降低中華絨螯蟹胰蛋白酶活性, 因為植酸對金屬離子有強烈的螯合特性, 植酸會與酶蛋白爭奪輔因子而致使消化酶活力下降。同時, 飼料中的蛋白質也會被作為植酸的優選結合底物[26], 被植酸絡合后無法完全有效供給動物體吸收利用[19], 這樣就會降低中華絨螯蟹對蛋白質的利用。實驗發現當植酸酶添加量達到2000 U/kg時, 中華絨螯蟹肝胰腺胰蛋白酶活力明顯升高, 且達到與對照組相當的水平, 表明該植酸酶劑量能有效緩解了植酸對消化酶的抑制, 提高機體對蛋白質的消化利用率。此外, 肝胰腺中淀粉酶活力的提高可能與植酸酶釋放的金屬離子Ca2+有關[19], 相關的具體過程和內在機制尚有待進一步研究。

甲殼動物的生長伴隨著蛻殼而實現, 這一過程中將會伴隨一些礦物質元素的損失, 所以飼料中鈣磷含量, 以及兩者之間的比例對于維持體壁結構起重要作用[27]。為了保證蛻殼的順利完成, 甲殼動物會在蛻殼期儲存磷, 這些磷主要來源于肝胰腺和血淋巴, 飼料中磷的缺乏會造成蛻殼延緩或蛻殼不遂,最終導致生長受阻, 甚至死亡[28]。本實驗所用礦物質配方參考Ma等[29]和Cui等[30], 且符合陳立僑等[31]對中華絨螯蟹飼料中鈣磷比的研究: 當餌料中含鈣量為0.5%、Ca/P比為1:1.9時, 幼蟹獲得最大生長率和較高蛋白質利用率, 滿足中華絨螯蟹對礦物質磷的基本需求。有學者報道, 當羅氏沼蝦飼料中植酸含量超過21.45 g/kg時, 蝦體總磷含量顯著的降低[6]。但當南美白對蝦(Litopenaeu vannamei)飼料中添加2000 U/kg植酸酶時, 磷的消化率由37%有效提高至47%[32]。植酸酶還能有效降低動物體磷的排泄量,顯示出效用價值[33]。飼料中的植酸會螯合礦物質磷, 而甲殼動物這類單胃動物基本無法消化植酸磷。在本研究中, 飼料中植酸酶分解植酸, 提高有效磷含量, 進而也提高了中華絨螯蟹對磷的消化利用。磷保留率由20.89%顯著上升到41.29%, 有效降低了元素的損失率。

有研究指出, 植物蛋白源替代魚粉可能會損失更多的氮元素, 當水生動物攝食氨基酸不平衡的飼料, 會分解不能利用的氨基酸, 導致的過多排泄[34]。水體中氨氮大部分來源于動物體自身排泄, 若氨氮含量過高, 非離子氨會通過鰓滲入血液, 對動物體產生毒害作用, 致使代謝異常,甚至死亡[35]。本實驗結果表明, 由于植酸螯合物的不可消化性, 中華絨螯蟹在攝入氮元素相同的情況下, 植酸添加組中華絨螯蟹的氮保留率較低。而在添加植酸酶后, 飼料中氮物質的利用得以提高, 蟹體氮保留率由18.47%顯著上升至25.78%。提示植酸酶能夠有效消除植酸對氮營養物質的結合作用, 促使植酸釋放出一些氨基酸、以及大分子蛋白質物質, 供給動物體有效消化吸收和利用, 從而降低飼料氮的排泄, 這對于養殖水環境的保護也是有益的[10]。

4 總結

與不添加植酸酶處理組相比, 隨著飼料中植酸酶的添加, 中華絨螯蟹肝胰腺中胰蛋白酶、對磷與蛋白質的消化利用率逐漸提高。飼料中添加2000 U/kg植酸酶能顯著提高幼蟹的增重率, 提高機體的磷含量、氮/磷保留率和飼料效率。