基于微衛星標記的圓口銅魚親子鑒定技術

何勇鳳 朱永久 吳興兵 龔進玲 楊德國

(中國水產科學研究院長江水產研究所, 農業農村部淡水生物多樣性保護重點實驗室, 武漢 430223)

圓口銅魚[Coreius guichenoti(SauvageetDabry)],隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、亞科(Gobioninae)、銅魚屬(Coreius), 主要分布于長江上游干流及雅礱江、烏江等大型支流中, 是典型的河道洄游性魚類和產漂流性卵魚類[1—3]。圓口銅魚為長江上游特有魚類, 也是重要的經濟魚類。圓口銅魚的產卵場僅發現于金沙江中下游以及雅礱江干流下游[4—6], 隨著長江上游水電開發的逐步實施, 不僅其完成生活史的通道因筑壩截流而被阻, 而且其產卵場環境有可能遭受毀滅性破壞。同時, 由于長期的過度捕撈、無節制的資源掠奪,圓口銅魚種群資源呈現明顯的下降趨勢, 如20世紀60—70年代在金沙江下游占漁獲量的50%以上[1],在金沙江下游宜賓江段由20世紀90年代占漁獲量的11.53%下降至2005年的7.93%[7], 在金沙江下游綏江段由2011年占漁獲量的12.98%下降至2015年的4.16%[8], 而由于金沙江一期工程的修建蓄水, 金沙江下游水富/宜賓斷面圓口銅魚的早期資源補充量由2008年的2.12億粒(尾)下降至2012年的0.82億粒(尾), 2013年更是呈現無圓口銅魚早期資源補充的狀況[9]。由此可見, 其物種生存與延續面臨巨大的威脅。開展圓口銅魚增殖放流是保護圓口銅魚資源的重要手段。目前, 已有多個水電工程將圓口銅魚列為增殖放流對象, 多家科研單位對圓口銅魚人工馴養與繁殖技術開展攻關研究, 并取得了突破性進展。隨著圓口銅魚增殖放流逐步開展和人工養殖逐漸增多, 如何快速有效地鑒別不同的圓口銅魚家系及來源, 是高效評估圓口銅魚增殖放流效果、加強養殖及自然種群遺傳管理以防止近親交配導致其種群遺傳多樣性下降的關鍵技術支撐。

親子鑒定(Parentage identification), 又稱親權鑒定, 是利用生物學、分子遺傳學及醫學的理論和技術, 從子代和親代的形態構造、生理機能、遺傳物質基礎等方面來分析遺傳特征, 判斷親代與子代之間是否具有親緣關系的方法, 其遺傳學基礎是孟德爾基因分離定律和基因自由組合定律。親子鑒定不僅在法醫學上有重要作用, 而且在水生生物、畜牧業生產中具有重要實際應用價值, 如建立系譜檔案以避免或減少近親繁殖造成的種群衰退、增殖放流效果評估等[10—12]。目前用于親子鑒定的DNA標記主要有微衛星標記(Simple sequence repeats,SSR)、SNP標記和線粒體標記等, 其中SSR標記由于具有多態性豐富、雜合度高、穩定性好、共顯性遺傳、遵循孟德爾遺傳定律、檢測快速方便等優點, 在魚類親子鑒定中得到了廣泛應用, 如中華鱘(Acipenser sinensisGray)、川陜哲羅鮭(Hucho bleekeriKimura)、大西洋鱈(Gadus morhuaLinnaeus)、胭脂魚[Myxocyprinus asiaticus(Bleeker)]、青魚[Mylopharyngodon piceus(Richardson)]、草魚[Ctenopharyngodon idellus(CuvieretValenciennes)]、翹嘴鱖[Siniperca chuatsi(Basilewsky)]等[10—16]。然而, 目前并無將微衛星標記應用于圓口銅魚親子鑒定的報道。

本研究以圓口銅魚人工繁殖家系群體為實驗材料, 結合文獻中已報道的微衛星標記, 建立圓口銅魚微衛星親子鑒定技術, 以期為圓口銅魚的家系管理、種群遺傳管理和增殖放流效果評估提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2017年6—7月期間, 在中國水產科學研究院長江水產研究所武漢研究中心養魚車間挑選健康成熟的圓口銅魚親本進行人工繁殖。按雌雄數量1:1比例得到5個全同胞家系(JX1—JX5), 每個家系隨機選取32—40尾子代, 分別為Z1-01—Z1-40、Z2-01—Z2-40、Z3-01—Z3-32、Z4-01—Z4-40、Z5-01—Z5-34; 按雌雄數量X:X比例(非1:1比例)得到3個混合家系(JX6—JX8), 每個家系隨機選取34—41尾子代, 分別為Z6-01—Z6-36、Z7-01—Z7-34、Z8-01—Z8-41; 其中家系JX1的父本、母本分別為F1、M1; 家系JX2的父本、母本分別為F2、M2; 家系JX3的父本、母本分別為F3、M3; 家系JX4的父本、母本分別為F4、M4; 家系JX5的父本、母本分別為F5、M5; 家系JX6的父本為F61、F62, 母本為M6; 家系JX7的父本為F4、F5和F7, 母本為M4、M5; 家系JX8的父本為F81、F82、F83、F84、F85, 母本為M81、M82、M83。候選親本樣本由22尾真正親本(父本: F1、F2、F3、F4、F5、F61、F62、F7、F81、F82、F83、F84、F85; 母本:M1、M2、M3、M4、M5、M6、M81、M82、M83)和20尾非親本(雌雄各10尾)樣本組成。同時, 采集了長江上游瀘州江段23尾野生個體作為引物篩選的樣本。采用無水乙醇保存候選親本的鰭條樣本及子代剛孵化出膜的全魚樣本, 4℃保存備用。

1.2 實驗方法

基因組DNA提取采用Omega Bio-Tek公司的Tissue DNA Kit(D3396)試劑盒提取圓口銅魚樣本基因組DNA, 采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和完整性, 于-20℃保存。

引物篩選從文獻中發表的圓口銅魚微衛星標記中篩選出40對微衛星引物[17—20], 由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。以65尾圓口銅魚個體(包括22尾候選親本、20尾非親本和23尾野生個體)DNA為模板來進行PCR擴增, PCR反應體系15 μL, 包括2×TaqPCR Master Mix 7.5 μL、基因組DNA模板(濃度50 ng/μL)0.5 μL、上游引物(濃度10 pmol/μL) 1 μL、下游引物(濃度10 pmol/μL) 1 μL、ddH2O 5 μL。PCR擴增程序為: 95℃預變性5min;95℃變性30s, 62℃→52℃ touch down退火30s, 72℃延伸30s, 進行10個循環; 95℃變性30s, 52℃退火30s, 72℃延伸30s, 進行22個循環; 最后72℃再延伸20min。采用12%聚丙烯酰胺凝膠對PCR擴增產物進行電泳分離, 檢測引物的擴增效果和擴增效率。

熒光標記及基因分型依據每對微衛星引物擴增片段的大小, 對篩選出的微衛星引物進行兩兩組合, 組合內的引物分別在F引物的5′端加上熒光標記(FAM、HEX、ROX或TMR), 由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。利用此熒光引物對圓口銅魚DNA樣品進行降落PCR擴增, PCR反應體系10 μL, 包括2×TaqPCR Master Mix 5 μL、基因組DNA模板(濃度50 ng/μL)1 μL、上游引物(濃度10 pmol/μL) 0.1 μL、下游引物(濃度10 pmol/μL) 0.4 μL、帶FAM熒光的M13引物(序列: TGTAAAACGACG GCCAGT, 濃度10 pmol/μL) 0.4 μL、ddH2O 3.1 μL。降落PCR擴增程序同引物篩選部分。在PCR結束后, 取2 μL PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠上電泳檢測其濃度, 根據濃度鑒定值對產物進行稀釋, 組成二重組合, 各取1 μL 稀釋PCR產物加入到7 μL含有熒光內標LIZ500的甲酰胺中, 使用測序儀ABI 3730XL對產物進行毛細管熒光電泳檢測和基因分型。

親子鑒定分析根據測序儀分型結果, 利用軟件GeneMarker v.2.2.0[21]讀取個體等位基因大小,并加以人工校正, 獲得基因型數據矩陣。采用軟件Cervus v.3.0[22]對基因型數據進行等位基因頻率分析、模擬分析和親子分析, 統計參數主要包括等位基因數(Number of allele,Na)、期望雜合度(Expected heterozygosity,He)、觀測雜合度(Observed heterozygosity,Ho)、多態信息含量(Polymorphism information content,PIC)、無效等位基因頻率(Null allele frequency,F(Null))、哈迪溫伯格平衡檢測(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)、平均排除概率(Exclusion probability,EP)、累積排除概率(Combined exclusion probability,CEP)、似然率對數值(The nature log of the overall likelihood ratio,LOD)以及置信度(Confidence)。

2 結果

2.1 微衛星標記的篩選

本研究從已報道的40對圓口銅魚微衛星引物中篩選出20對多態性較高、擴增效果較好的微衛星引物(表 1), 用于建立二重毛細管電泳和親子鑒定。將20對微衛星引物進行不同的熒光標記后, 單獨進行PCR擴增, PCR擴增產物兩兩組合, 使用測序儀ABI 3730XL對組合后的產物進行毛細管熒光電泳檢測和基因分型, 從而建立10組圓口銅魚微衛星標記的二重毛細管電泳技術。

利用篩選出的10組20個微衛星標記對圓口銅魚65尾個體擴增結果顯示, 單個位點等位基因數(Na)為5—31個, 平均等位基因數為10.45個; 多態信息含量(PIC)為0.337—0.949, 平均值為0.652; 期望雜合度(He)為0.366—0.958, 平均值為0.696, 觀測雜合度(Ho)為0.415—0.923, 平均值為0.697。所有位點均符合哈迪溫伯格平衡(P＞0.05)。

2.2 遺傳多樣性

利用10組20個微衛星標記對圓口銅魚42尾候選親本和297尾子一代進行擴增, 結果顯示, 20個位點檢測的等位基因數為180個, 單個位點等位基因數(Na)為5—27個, 平均等位基因數為9個; 多態信息含量(PIC)為0.219—0.884, 平均值為0.616; 期望雜合度(He)為0.226—0.895, 平均值為0.659, 觀測雜合度(Ho)為0.222—0.950, 平均值為0.691。所有位點的無效等位基因頻率F(Null)均低于0.1。HWE檢驗顯示, 8個位點符合哈迪溫伯格平衡(P＞0.05), 12個位點顯著偏離哈迪溫伯格平衡(P＜0.05)。20個位點在圓口銅魚339個家系樣本中具體遺傳參數見表 2。

利用10組微衛星標記對圓口銅魚8個家系子一代群體和候選親本群體單獨進行遺傳多樣性分析,結果顯示, 子一代群體的平均等位基因數為3.02, 平均多態信息含量為0.459, 平均期望雜合度為0.529,平均觀測雜合度為0.689; 候選親本群體的平均等位基因數為8.95, 平均多態信息含量為0.647, 平均期望雜合度為0.694, 平均觀測雜合度為0.702 (表 3)。由此可見, 圓口銅魚子一代群體的遺傳多樣性明顯低于候選親本群體。

2.3 排除概率

排除概率分析結果顯示, 當雙親基因型未知時,單個微衛星位點的單親排除概率(E-1P)為0.027—0.643, 平均值為0.296, 單親累積排除概率(CE-1P)為0.99954473; 當單親基因型已知時, 單個微衛星位點的排除概率(E-2P)為0.123—0.784, 平均值為0.449, 累積排除概率(CE-2P)為0.99999825; 當雙親基因型未知時, 單個微衛星位點的雙親排除概率(E-PP)為0.225—0.926, 平均值為0.613, 雙親累積排除概率(CE-PP)為1.00000000 (表 4)。

2.4 親子分析

模擬和親子分析中, 參數設置為: 模擬10000次親子鑒定, 置信度為95%, 候選父母本數均為200,父母本的抽樣比例為0.85。Parent pair分析結果顯示, 隨著微衛星位點的增加, 圓口銅魚親子鑒定準確率在不斷的提高(圖 1), 尤其當使用20個微衛星位點時, 297尾子一代均能正確找到其父母本, 親子鑒定準確率為100%; 所有子一代個體的TrioLOD值均大于0, 其中全同胞和半同胞家系(JX1-JX6)所有222尾子一代的置信度均達到95%, 而混合家系(JX7-JX8)75尾子一代中除9尾子一代的置信度僅達到80%外, 其余子一代個體置信度也達到了95%; 所有子一代個體中有224尾個體(占總個體數的75.4%)未出現錯配位點, 有49尾個體(占總個體數的16.5%, 其中全同胞家系子一代僅11尾個體)出現1個錯配位點, 有18尾個體(占總個體數的6.1%, 全部為混合家系子一代)出現2個錯配位點, 有6尾個體(占總個體數的2.0%, 全部為混合家系子一代)出現3個錯配位點。

3 討論

3.1 基于微衛星標記的圓口銅魚親子鑒定技術

多態信息含量(PIC)是衡量位點多態性的重要指標, 一般認為當PIC0.25為低度多態, 0.25＜PIC＜0.5為中度多態,PIC＞0.5為高度多態[23]。本研究20個微衛星位點在圓口銅魚野生群體中有16個位點呈現高度多態性, 4個位點呈現中度多態性, 說明這20個微衛星位點能提供豐富的遺傳信息。本研究的20個微衛星位點在圓口銅魚人工繁殖的親本群體和子代群體中有12個位點顯著偏離哈迪溫伯格平衡, 其中10個位點表現為雜合子過?，F象, 可能是因為有限的親本繁殖子代導致連鎖不平衡現象引起的, 另2個位點表現為雜合子缺失, 可能是因為小種群中非隨機交配等原因造成的。但這20個微衛星位點在圓口銅魚野生群體中均不偏離哈迪溫伯格平衡, 而且在雙親信息未知、單親信息已知、雙親信息已知的情況下, 其20個微衛星位點的累積排除概率均大于99.99%。因此, 本研究篩選出的20個微衛星位點, 可作為有效的遺傳標記進一步用于圓口銅魚的親子鑒定分析。

表1 圓口銅魚微衛星引物序列、熒光物質和多重毛細管電泳組合信息Tab. 1 Sequence, fluorescence label and group information of multiple capillary electrophoresis of microsatellite primers in Coreius guichenoti

在水生生物的親子鑒定研究中, 最常用的鑒定方法是基于似然比的似然法, 其中似然率對數值LOD、置信度和錯配位點數是關鍵指標。LOD值等于0表示候選父親與群體中隨機雄性個體成為子代真實父親的可能性相同,LOD值小于0表示候選父親不可能為子代的真實父親,LOD值大于0則認為候選父親最有可能是子代的真實父親,LOD值越大, 可靠性越高[22]。在本研究中通過20個微衛星位點檢測了圓口銅魚8個家系子一代個體與候選親本間的親子關系, 圓口銅魚親子鑒定的準確率達到了100%, 而且所有子一代個體的LOD值均大于0, 置信度達到95%的子一代個體數量占97.0%, 未出現錯配位點和僅出現1個錯配位點的子一代個體數量占91.9%。這說明基于本研究篩選出的20個微衛星標記建立的圓口銅魚親子鑒定技術是可靠的, 可進一步用于圓口銅魚的家系管理、種群遺傳管理和增殖放流效果評估等方面的研究。

表2 采用20個微衛星位點檢測獲得圓口銅魚遺傳多樣性參數Tab. 2 Genetic diversity parameter of Coreius guichenoti by using 20 microsatellite markers

表3 圓口銅魚子一代群體和候選親本群體遺傳多樣性參數Tab. 3 Genetic diversities of parents and offspring in Coreius guichenoti

3.2 圓口銅魚親本貢獻率分析

本研究中涉及圓口銅魚5個全同胞家系和3個混合家系, 在全同胞家系中親本對子代的貢獻率是已知的, 而在混合家系中親本對子代的貢獻率大小卻是未知的。因此, 本研究通過親緣關系分析了在混合家系中圓口銅魚不同親本對子代的貢獻率大小, 這有助于指導圓口銅魚的人工繁育生產過程。在本研究3個混合家系中半同胞家系JX6的父本F61和F62對子代的貢獻率分別為94.44%和5.56%,母本M6對子代的貢獻率為100%; 混合家系JX7的父本F4、F5、F7對子代的貢獻率分別為0、11.76%、88.24%, 母本M4、M5對子代的貢獻率分別為0、100%; 混合家系JX8的父本F81、F82、F83、F84、F85對子代的貢獻率分別為0、73.17%、24.39%、0、2.44%, 母本M81、M82、M83對子代的貢獻率分別為2.44%、95.12%、2.44%。由此可見, 在圓口銅魚人工繁殖過程中, 盡管采用了多對多配對方式, 但不同親本對子代的貢獻率存在顯著差異, 可能是由于某些親本的配子受精率、成活率低等原因造成的。實際上, 這種貢獻的不均衡可能會導致一些等位基因的丟失, 通過累代的繁殖, 可能會造成子代群體遺傳多樣性水平的降低。因此,在圓口銅魚人工繁殖生產過程中, 作者建議及時發現貢獻率低下的親本, 適時剔除, 補充新親本個體,從而達到改良產卵群體和減少保種壓力的目的。

表4 圓口銅魚20個微衛星位點排除概率和累積排除概率Tab. 4 Exclusion probability and combined exclusion probability of twenty microsatellites in Coreius guichenoti

圖1 不同微衛星位點數目下的圓口銅魚親子鑒定準確率Fig. 1 The assignment success rate of progeny to correct parent pair based on parent and offspring genotypes of Coreius guichenoti

綜上所述, 在對文獻記載的40對微衛星引物篩選的基礎上, 本研究利用篩選出的20對微衛星引物對8個圓口銅魚家系樣本進行微衛星DNA基因分型研究, 親子鑒定準確率達到100%, 所有子一代個體的LOD值均大于0, 置信度達到95%的子一代個體數量占97.0%, 未出現錯配位點和僅出現1個錯配位點的子一代個體數量占91.9%, 建立了以20個微衛星標記為基礎的圓口銅魚熒光微衛星標記與多重毛細管電泳相結合的親子鑒定技術, 可為圓口銅魚的家系管理、種群遺傳管理和增殖放流效果評估提供科學依據。