高壓脈沖電場技術在實驗教學中的應用

張 燕， 趙頌寧， 赫桂丹， 劉博群， 劉靜波

(吉林大學 食品科學與工程學院， 長春 130062)

0 引 言

高壓脈沖電場技術(High Intensity Pulsed Electric Fields, PEF)是高電壓工程和脈沖功率技術的結合，是最具有工業化應用前景的非熱加工技術之一[1]。由于其低能耗、處理快速、且能避免或極大地降低食品在處理過程中的感官品質和物理特性的變化，很大程度地保持食品的原有品質，在食品工程和生物學領域應用廣泛[2-4]。

在我校功能性食品實驗教學中，開放性、設計性綜合實驗教學是其特色，實驗的選題為實際樣品中功能成分的提取、分析檢測及功能學評價等。如“植物功能因子的提取技術”就是以“漿果之王”藍莓為原料，因其中含有大量的酚類和花青素類物質，能有效清除體內自由基，具有很高的抗氧化活性[5-8]。傳統實驗對藍莓中花青素、多酚等功效成分的提取多采用熱回流法，加熱處理會造成花青素和多酚物質的降解破壞，有效成分含量下降[9-12]。本文建立的高壓脈沖電場法提取藍莓中多酚類物質，采用響應面分析法對提取工藝進行了優化，增加了教學實驗的開放性與設計性，有利于學生創新性思維的開發、教學質量的提高。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

PEF裝置(頻率1～3 kHz；處理液流速0～100 mL/min；處理室直徑1 mm;脈寬為1 μs)；

電子天平，BT25S，瑞士梅特勒-托利多公司；

紫外分光光度計，UV2550，日本島津公司；

干燥箱，PH-070A，上海一恒科學儀器有限公司。

冷凍藍莓果，由吉林大學提供；氫化錦葵色素-3-B-葡糖苷，Sigma公司；無水乙醇、濃鹽酸、碳酸鈉、福林酚試劑，均購自北京化工廠。

1.2 單因素實驗設計

稱取藍莓，磨漿，加入乙醇，調節pH值，均質，高壓脈沖電場作用，放置12 h，過濾，取上清液，測定吸光度值。以總酚得率為評價指標，考察料液比、乙醇濃度、pH值、電場場強、脈沖數對總酚得率的影響，單因素設計與水平見表1。

表1 單因素設計與水平

1.3 響應面實驗方案設計

根據單因素試驗結果，利用Design-Expert 8.0.5軟件中的 Box-Behnken中心組合試驗設計原理，以多酚類化合物含量為響應值，通過響應面分析進行提取條件的優化，各因子編碼與取值水平見表2。

1.4 標準曲線的繪制

準確稱取20 mg沒食子酸標準品，用去離子水配制成濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸標準溶液。精確量取上述標準液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL于50 mL容量瓶中，加入30 mL水，搖勻，再加入2.5 mL福林酚(FC)試劑，搖勻。0.5～8 min內加入

表2 響應面實驗因素與水平

7.5 mL碳酸鈉溶液(20%)，混勻定容至刻度。避光，室溫靜置1 h，在750 nm處測定吸光度值，并建立標準曲線。

2 實驗結果及分析

2.1 標準曲線的建立

以沒食子酸標準溶液濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，制得標準曲線如圖1所示，回歸方程為y=1.97x+0.021 1，R2=0.999 9。

圖1 總酚標準曲線圖

2.2 單因素試驗結果及分析

(1) 料液比的影響。在pH 2，電場場強45 kV/cm，乙醇濃度60%，脈沖數6的條件下，料液比分別選擇10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、1∶60，高壓脈沖電場作用后室溫浸提12 h，過濾，測定吸光度值，結果如圖2所示。

圖2 料液比對總酚得率的影響

從圖2中可以看出，料液比在30∶1～50∶1之間時，總酚得率較高，其中在40∶1時得率達到31.10%。當料液比大于50∶1時，總酚得率略微降低。

(2) 乙醇濃度的影響。在pH2，電場場強45 kV/cm，料液比30∶1，脈沖數6的條件下，乙醇濃度分別選擇0%、20%、40%、60%、80%、100%，高壓脈沖電場作用后室溫浸提12 h，過濾，測定吸光度值，結果如圖3所示。

圖3 乙醇濃度對總酚得率的影響

從圖3中可以看出，乙醇濃度在60%～80%之間時，總酚得率較高，其中在80%時得率達到33.46%。當乙醇濃度較高或較低時，總酚得率降低。

(3) pH值的影響。在乙醇濃度60%，脈沖數6，料液比30∶1，電場場強45 kV/cm的條件下， pH分別選擇1～6，高壓脈沖電場作用后室溫浸提12 h，過濾，測定吸光度值，結果如圖4所示。

圖4 pH值對總酚得率的影響

從圖4中可以看出，pH值在2～4之間時，總酚得率較高，其中在pH3時得率達到31.00%。

(4) 電場場強的影響。在料液比30∶1，乙醇濃度60%，pH 2，脈沖數6的條件下，電場場強分別選擇15、30、45、60、70 kV/cm，高壓脈沖電場作用后室溫浸提12 h，過濾，測定吸光度值，考察電場場強對其的影響。結果如圖5所示。

圖5 電場場強對總酚得率的影響

從圖5中可以看出，電場場強在30～60 kV/cm之間時，總酚得率較高，其中在45 kV/cm時得率達到30.31%。當電場場強達到60、70 kV/cm，總酚得率明顯降低。

(5) 脈沖數的影響。在料液比30∶1，乙醇濃度60%，pH=2，電場場強45 kV/cm的條件下，脈沖數分別選擇2、4、6、8、10，高壓脈沖電場作用后室溫浸提12 h，過濾，測定吸光度值，結果如圖6所示。

圖6 脈沖數對總酚得率的影響

從圖6中可以看出，脈沖數在4～8之間時，總酚得率較高，其中在6時得率達到31.38%。

2.3 響應面法優化多酚類化合物提取條件實驗結果

(1) 實驗設計及結果。通過單因素實驗，確定pH值在2～4、料液比在30∶1～50∶1、乙醇濃度在60%～80%，電場場強在30～60 kV/cm，脈沖數在4～8時，總酚得率較高。為進一步優化藍莓總酚提取條件，以總酚得率為響應值，應用Design-Expert 8.0.5b軟件中Box-Behnken 試驗設計原理設計響應面實驗，實驗結果見表3。由表3可見，第36個處理組總酚的得率最高，即在料液比40∶1、乙醇濃度75%、pH 3、電場場強45 kV/cm、脈沖數6的處理條件下，總酚得率可達到36.88%。

(2) 回歸模型的建立及方差分析。對響應面實驗結果進行回歸分析，建立多項式回歸模型，得到各因子編碼值的回歸方程

總酚得率=34.55-2.76A-1.46B-3.29C-

2.82D+1.19E+4.93AB+2.05AC+

0.87AD+0.94AE+1.14BC+1.00BD-

0.16BE-1.01CD-1.30CE-1.36DE-

4.92A2-7.76B2-8.06C2-5.96D2-7.09E2

對總酚得率的二次回歸方程進行顯著性檢驗及方差分析，結果見表4。表4結果顯示，該模型(P<0.000 1)，具有高度顯著性，表明模型成立。模型失擬項P=0.199 3>0.1，不顯著，說明模型預測值和真實情況間無顯著性差異，模型擬合度較好。在回歸模型中一次項A、B、C、D、E，交互項AB，二次項A2、B2、C2、D2、E2均表現出顯著水平。通過F值的比較，得出該模型各因素對響應值總酚得率影響的顯著性大小為pH值>料液比>電場場強>乙醇濃度>脈沖數。

(3) 總酚得率響應面分析圖。各因素之間兩兩交互作用分析等值線和曲面如圖7所示。由圖7中曲面圖可以看出，各圖均呈開口向下，凸形的曲面，具有極值。等高線圖中由圖7(a)可以看出，料液比(A)和乙醇濃度(B)等高線圖呈橢圓形，說明兩者之間交互作用極顯著，隨著料液比和乙醇濃度不斷增大，多酚得率呈現先增大后減小的趨勢。其他幾個因素兩兩間交互作用等高線圖呈圓形，說明交互作用不顯著，在實驗范圍內隨著兩者不斷增大，總酚得率呈先增大后減小的趨勢。當乙醇濃度固定不變時，總酚得率隨料液比、pH值、電場場強和脈沖數的增加而先增加后降低，可能是因為高壓脈沖電場處理過的液體顆粒度降低，增大顆粒與溶劑的接觸面積，得率增大。但當電場場強和脈沖數過大時，總酚得率迅速下降，可能因為破壞了總酚的結構從而影響了得率[14-15]。當電場場強和脈沖數固定不變時，乙醇濃度增加，總酚得率先增加后降低。

表3 響應面實驗結果

表4 二次回歸方程方差分析

注：**表示該水平極其顯著(P<0.01)；*表示該水平顯著(P<0.05)

通過響應面分析法對實驗數據進行優化后，可以得出藍莓多酚類化合物提取的最佳工藝參數為：料液比34.99∶1、乙醇濃度70.60%、pH值2.72、電場場強

(a) 料液比和乙醇濃度對總酚得率的影響

(b) 料液比和pH值對總酚得率的影響

(c) 料液比和電場場強對總酚得率的影響

(d) 料液比和脈沖數對總酚得率的影響

(e) 乙醇濃度和pH值對總酚得率的影響

(f) 乙醇濃度和電場場強對總酚得率的影響

(g) 乙醇濃度和脈沖數對總酚得率的影響

(h) pH值和電場場強對總酚得率的影響

(i) pH值和脈沖數對總酚得率的影響

(j) 電場場強和脈沖數對總酚得率的影響

圖7 響應面分析圖

40.70 kV/cm、脈沖數6.22，預測總酚的得率為36.381 6%。為了驗證實驗結果與實際情況是否一致，進一步做了驗證實驗，考慮到實驗的方便性，將各因素數值進行取整后最佳工藝參數為：料液比35∶1、乙醇濃度70%、pH值2.7、電場場強40 kV/cm、脈沖數6，所得總酚得率為36.4%，與預測值的差異小于0.05%。因此，利用響應面法對高壓脈沖電場提取藍莓中酚類化合物的條件是可行的，得到的多酚類化合物的提取方法具有實際應用價值，為實驗操作提供技術參考。

3 結 語

本實驗將學生在食品專業基礎課中學到的功能因子高效分離技術理論知識，結合現代高新提取技術，應用到功能性食品教學實驗中。即將高壓脈沖電場技術應用于功能性食品植物有效成分提取實驗中，在老師的指導下，學生自主設計實驗方案，運用單因素及響應面分析法設計實驗，和傳統教學實驗“冷浸法提取藍莓中酚類化合物”相比，本研究將現代大型儀器與實驗教學相結合，不僅提高了藍莓中多酚類化合物得率，采用不同的提取手段實現設計意圖，還增加了教學實驗的開放性和研究性，有利于豐富食品科學專業本科實驗教學手段，有利于現代分離提取儀器在食品科學專業實驗教學中的應用，有利于提高學生運用新技術分析、解決復雜工程問題的能力[16-17]。因此，這一成果的應用對于實驗教學內容的豐富及教學質量的提高都有積極的影響。