中耳炎小鼠模型的聽力學特點

肖聰聰 李博 鄭體花 鄭慶印

(煙臺濱州醫學院，山東 煙臺 264000)

中耳炎的病程遷延，可引起注意力、認知感及聽力下降，從而影響生活質量，嚴重者可以并發顱內外并發癥而危及生命〔1～3〕。中耳炎是導致聽力下降的主要原因，及時對其診斷及治療有著重要意義。中耳炎小鼠模型的建立對中耳炎易感基因的識別處理及藥物開發尤為重要，但是關于中耳炎小鼠模型的聽覺特點尚不清楚，因此對中耳炎小鼠模型的聽力損失程度及性質進行評估尤為重要。聽性腦干反應(ABR)測試是聽功能研究的重要指標和手段，具有客觀、易操作且能夠反映病變的部位及通路，已廣泛應用于動物模型的聽力評估。本研究通過對C57小鼠，Toll樣受體(TLR)2-/-小鼠的中耳炎模型進行ABR測試，觀察兩種小鼠在不同刺激聲下的ABR的反應閾和潛伏期，為中耳炎小鼠模型的聽覺研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 C57小鼠、TLR2-/-小鼠各20只(南京大學模式動物研所提供)(20耳，均選擇左耳測試)，均為雌性，聽力正常，7周齡，體重18～28 g。分為4組，中耳炎造模前C57小鼠一組(20只)作為對照組，中耳炎造模后C57小鼠一組(20只)作為實驗組，中耳炎造模前TLR2-/-小鼠一組(20只)作為對照組，中耳炎造模后TLR2-/-小鼠一組(20只)作為實驗組，即兩種品系小鼠造模前兩組對照組各20只，造模后兩組實驗組各20只。

1.2中耳炎動物模型的建立 兩對照組均正常飼養，其余兩實驗組均在麻醉狀態下向左耳中耳腔鼓室注射鏈球菌肽聚糖多糖(PGPS)(濃度為6 μg/μl，每只注射10 μl，美國BD公司)，3 d后使用內鏡觀察中耳鼓室情況。

1.3ABR檢測 分別對兩種品系小鼠的對照組和實驗組腹腔注射麻醉，記電極置顱頂，參考電極插入小鼠左耳與嘴角之間，接地電極插入右耳旁與左耳對稱。電極之間阻抗小于3 kΩ。開放聲場中揚聲器(TDT MFI-1250)放置于距外耳道口1 cm的地方，避免耳機接觸耳廓〔4〕。

采用美國TDT公司TDTⅢ設備和BioSigRP系統軟件給聲并采集信號〔5〕。刺激聲分別為校準好的click聲、tone burst(TB)聲(8、16、32 kHz)，強度為0～90 dB SPL，衰減間隔為10 dB，接近閾值時以5 dB減低以獲得最低聽閾值，帶通濾波100～3 000 Hz，重復率11次/s，觀察窗為10 ms，疊加1 024次記錄所有波形圖及各刺激聲下的閾值，根據閾值最有統計學意義的刺激聲條件下來判斷潛伏期。

1.4統計學分析 實用GraphPad Prism7統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.14組小鼠內鏡圖像 如圖1所示，麻醉狀態下，TLR2-/-小鼠實驗組耳內鏡發現中耳有滲出液，得到這種圖像的小鼠16只，TLR2-/-小鼠對照組使用耳內鏡觀察無異常現象。C57小鼠實驗組發現耳內鏡中耳有滲出液的11只，C57小鼠對照組使用耳內鏡觀察也無異常現象。

圖1 4組內鏡圖像

2.24組小鼠ABR反應閾 由表1可見，不同刺激聲下，TLR2-/-中耳炎模型小鼠和C57中耳炎模型小鼠的ABR反應閾均明顯高于其對照組，C57中耳炎模型小鼠的ABR反應閾在click聲和短純音8、16 kHz有統計學意義(P<0.05)，且對click聲最為敏感(P<0.01)，TLR2-/-中耳炎模型小鼠的ABR反應閾在click聲和短純音8、32 kHz差異有統計學意義(P<0.05)，同樣對click聲刺激最為敏感(P<0.01)。由表2可見，比較兩種中耳炎模型小鼠的實驗組發現，TLR2-/-中耳炎模型小鼠的ABR反應閾高于C57中耳炎模型小鼠，在click聲和短純音8 kHz刺激聲下的ABR反應閾差異有統計學意義(P<0.01)，且在click聲刺激下更有比較意義(P<0.001)。

表1 4組不同刺激聲下的ABR反應閾耳)

與同鼠種對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；表3同

表2 TLR2-/-中耳炎模型和C57中耳炎模型的ABR反應閾耳)

與C57小鼠實驗組比較：1)P<0.01，2)P<0.001

2.34組小鼠click聲下的ABR各波潛伏期 如表3所示，TLR2-/-小鼠實驗組和C57小鼠實驗組的Ⅰ波，Ⅱ波和Ⅳ波潛伏期均較其對照組延長，C57小鼠Ⅰ波和Ⅱ波潛伏期較其對照組延長更明顯，差異均有統計學意義(P<0.05)。如圖2所示，為麻醉狀態下小鼠在click聲刺激下的ABR波形圖，量取4組小鼠在80 dB SPL強度下Ⅰ波，Ⅱ波和Ⅳ波的潛伏期。

圖2 click聲刺激下ABR各波形

組別波Ⅰ波Ⅱ波ⅣTLR2-/-小鼠實驗組2.06±0.201)3.07±0.311)4.81±0.351)TLR2-/-小鼠對照組1.58±0.062.26±0.104.16±0.10C57小鼠實驗組1.85±0.141)3.16±0.251)4.66±0.071)C57小鼠對照組1.76±0.082.80±0.134.57±0.11

3 討 論

本研究顯示向TLR2-/-小鼠和C57小鼠鼓室注射PGPS可以成功誘導中耳炎，內鏡圖像顯示中耳有滲出液，說明中耳炎小鼠模型造模成功。兩種品系小鼠誘導后的中耳炎組ABR反應閾均高于對照組，且都在低頻刺激click聲差異最明顯，這與臨床中耳炎的ABR聽力特點相符，低頻刺激下ABR閾值升高。這可能是由于中耳炎發生時分泌積液，黏稠的分泌物使聲音阻抗力增加，傳導力減弱，造成閾值升高。有趣的是，與C57中耳炎模型小鼠對比，TLR2-/-中耳炎模型小鼠的ABR反應閾更高，聽力損失程度更嚴重。TLR2-/-小鼠是在C57小鼠的基礎上敲除TLR2基因的小鼠，說明TLR2基因缺陷的小鼠患中耳炎后聽力下降較正常小鼠更嚴重。這與上面提到的TLR2因子的缺失可能對聽力水平的降低造成影響有關。

TLRs是先天性免疫系統中的細胞跨膜受體及病原模式識別受體之一，在急性炎癥反應細胞吞噬作用的調節和細胞信號轉導及細胞凋亡中起重要作用〔6～8〕。TLR2是已經克隆的TLR家族中表達范圍最廣，識別病原微生物種類最多的成員〔9〕。它可單獨或協同其他Toll樣受體家族成員完成對病原體相關分子模式的識別，觸發機體對致病微生物的級聯免疫應答，尤其是針對細胞毒素的抗炎癥反應具有重要的作用，已經成為多種疾病治療的新靶點〔10，11〕。TLR2作為Ⅰ型跨膜轉運蛋白，在免疫炎癥反應過程中起著至關重要的作用。最近的一項研究表明，在人類中耳炎患者的中耳黏膜組織中TLR2表達水平明顯降低〔12～14〕，TLR2信號可能在中耳炎感染中起著關鍵調控作用。TLR2信號轉導通路主要分為 2 條途徑：依賴髓樣分化因子(MyD)88途徑和非依賴MyD88途徑(也稱為依賴TRIF 途徑)〔15〕。TLR2可通過與相應的配體結合形成二聚體復合物，并發生內部結構改變，從而招募包括接頭蛋白MyD88、TIR相關蛋白、類MyD88樣分子、干擾素誘導連接蛋白、人易位關聯膜蛋白以及包含TIR 結構域的分子蛋白(SARM)，然后啟動下游的炎癥反應〔16〕。但是TLR2 在炎癥相關性疾病中耳炎中的具體作用機制尚未清楚，有望進一步研究。

本實驗中，由于兩種品系中耳炎模型小鼠均在click聲刺激下最有統計學意義。兩組中耳炎小鼠模型均在Ⅰ波、Ⅱ波潛伏期延長。這可能是由于中耳積液時聲能傳導的阻抗變大，傳導至內耳的聲能減少，故Ⅰ波、Ⅱ波潛伏期延長，臨床上經常是以延時出現的Ⅰ波作為診斷中耳炎較好的指標，這與臨床結果也是相符的。

中耳炎小鼠模型已經有相關報道和研究，但是關于中耳炎小鼠模型的聽力特點尚未有相關探討。本研究首次探討中耳炎小鼠模型的聽覺特點，對中耳炎小鼠模型的聽力損失程度及性質進行評估，為臨床早期及時診斷中耳炎提供依據，尤其選擇TLR2-/-小鼠和C57小鼠這兩種品系的小鼠模型，意在探討TLR2因子的缺失與中耳炎的關系，為今后進一步研究中耳炎患病的分子機制，甚至將TLR2作為靶目標，利用現代醫學技術，為中耳炎的防治開辟新途徑。