穿心蓮內酯對氫化可的松誘導的免疫抑制小鼠免疫功能的影響

樊成紅 張曉延

(山西醫科大學汾陽學院檢驗系，山西 汾陽 032200)

穿心蓮別名春蓮秋柳、苦膽草，主要生長在我國南方廣東、福建各省，味苦性寒，是一種生爵床科草本植物。穿心蓮根部可提取出黃酮類化合物，葉部可提取內酯類化合物〔1〕。穿心蓮內酯為穿心蓮中提取的二萜內酯類化合物，是中藥穿心蓮的主要有效成分之一〔2〕。研究表明，穿心蓮內酯及其衍生物穿琥寧注射液、蓮必治注射液、病毒凈滴眼液、脫水穿心蓮內酯琥珀酸半酯等均具有消炎抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗心血管疾病、保肝利膽等功效，最顯著的為免疫刺激作用〔3,4〕。有研究報道，穿心蓮內酯可通過刺激機體產生各種免疫活性物質而發揮作用，具有調節機體非特異免疫功能，其對自然殺傷(NK)細胞、細胞因子的分泌具有調節作用〔5〕。但穿心蓮內酯的免疫調節作用未十分清楚。腸道菌群會產生大量的代謝酶，不同種類的細胞產生不同的代謝酶，不同的酶參與不同的藥物代謝。這些細菌可通過藥物活化使無活性的藥物轉化為有活性藥物，同時使有害物質無毒化，改善腸道菌群〔6〕。中藥和腸道菌群的相互作用對研究中藥藥效具有重要作用〔7〕。但穿心蓮內脂對腸道菌群的調節機制尚未完全清楚。本研究將建立氫化可的松誘導的免疫抑制小鼠模型，觀察高劑量和低劑量的穿心蓮內酯對小鼠巨噬細胞吞噬、腸道菌雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌含量的影響，揭示穿心蓮內酯可提高機體非特異性免疫力及改善腸道菌群，將可為穿心蓮內酯的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 昆明種小鼠60只(18～20 g)購自北京維通利華實驗動物公司。

1.2主要藥材、試劑 穿心蓮內酯購于天津匯綠公司，純度98%，批號：170825；腸桿菌培養基(VRPD)、雙歧桿菌選擇性培養基(BBL)、乳酸細菌培養基(MRS)、大豆酪蛋白瓊脂培養基(TSA)培養基均購自北納生物；氫化可的松注射液購自上海信宜藥廠，批號:160316；可溶性淀粉，天津市大茂化學試劑廠，批號：20170613；腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測試劑盒、白細胞介素(IL)-6檢測試劑盒、干擾素(IFN)-γ檢測試劑盒均購自碧云天。

1.3氫化可的松誘導免疫抑制小鼠模型的建立 隨機選取20只小鼠分為模型組、對照組。模型組小鼠灌胃氫化可的松，2次/d，0.2 ml/次(100 mg/kg)，連續3 d，制造小鼠免疫抑制模型；對照組灌喂等量生理鹽水。3 d后斷頸法處死小鼠，解剖摘取脾臟和胸腺，分別稱重并記錄。模型組小鼠的脾臟胸腺指數=脾臟重量(mg)/胸腺重量(g)。

1.4對免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬的測定 用超純水100 ml加入可溶性淀粉1 g充分溶解，于121℃高壓滅菌20 min，自然冷卻后4 ℃保存備用。抽取雞血5 ml，加入抗凝劑，1 500 r/min離心3 min,棄去上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，再次離心3 min。壓積細胞制備10 %紅細胞懸液。取40只小鼠隨機分成4組，每組10只，標記為對照組、模型組、高劑量穿心蓮內酯組、低劑量穿心蓮內酯組。按1.3方法對高劑量穿心蓮內酯組、低劑量穿心蓮內酯組和模型組建立小鼠免疫抑制模型，第4天開始，連續3 d，固定每日上午灌胃高劑量(200 mg/kg)和低劑量(100 mg/kg)的穿心蓮內酯，模型組腹腔注射等量的生理鹽水，對照組不做處理。第7天下午各組腹腔注射5 %無菌淀粉注射液0.5 ml，1 h后注射10 %雞紅細胞懸液1 ml，間隔1 h將小鼠處死，吸取腹腔滲出液涂片，瑞氏染色計數吞噬百分率。

1.5對免疫抑制小鼠腸道菌群的測定 采取各組小鼠腸道內容物于1 ml無菌EP管，取1 g置于裝有9 ml無菌無氧稀釋液的稀釋管中，充分搖蕩10 min，以此為第1管(10-1)，從中取1 ml注入第2管，以此類推，直至第10 管(10-10)。 測定雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌的含量。雙歧桿菌用BBL培養基厭氧培養，腸桿菌用VRPD培養基培養，乳酸桿菌用MRS培養基培養，腸球菌用TSA培養基培養，均在37 ℃培養箱中培養48～72 h。采用平板菌落計數法統計細菌量，最后用每克新鮮樣品中細菌個數的對數表示。

1.6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞中IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量 按照TNF-α檢測試劑盒、IL-6檢測試劑盒、IFN-γ檢測試劑盒操作要求檢測巨噬細胞中IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量

1.7統計學分析 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1氫化可的松誘導免疫抑制小鼠模型 與對照組相比，模型組小鼠脾臟指數、胸腺指數顯著降低(P<0.05)。見表1。氫化可的松成功誘導小鼠免疫抑制。

2.2氫化可的松對小鼠巨噬細胞吞噬能力及血清免疫因子表達的影響 與對照組比較，模型組巨噬細胞吞噬率顯著降低(P<0.05)，巨噬細胞吞噬指數顯著降低(P<0.05)，IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表1 氫化可的松對免疫小鼠免疫器官質量的影響

表2 氫化可的松對小鼠巨噬細胞的吞噬能力、血清免疫因子表達及腸道菌群的影響

2.3氫化可的松誘導小鼠腸道菌群失調 與對照組比較，模型組雙歧桿菌、乳酸桿菌含量顯著降低，腸桿菌、腸球菌含量顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.4穿心蓮內酯可逆轉氫化可的松對小鼠巨噬細胞吞噬能力及血清免疫因子表達的作用 低劑量穿心蓮內酯組、模型組與對照組比較，巨噬細胞吞噬率均顯著降低(P<0.05)，吞噬指數顯著降低，IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均顯著降低(P<0.05)；高劑量穿心蓮內酯組與對照組比較，巨噬細胞吞噬率和吞噬指數無明顯差異，IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均顯著降低(P<0.05)；高劑量穿心蓮內酯組、低劑量穿心蓮內酯組與模型組比較，細胞吞噬率和吞噬指數顯著升高，IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均顯著升高(P<0.05)； 高劑量穿心蓮內酯組與低劑量穿心蓮內酯組比較，細胞吞噬率和吞噬指數顯著升高，IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 穿心蓮內酯對氫化可的松誘導的免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響

與對照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；與低劑量穿心蓮內酯組比較:3)P<0.05；表4同

2.5穿心蓮內酯改善氫化可的松誘導的免疫抑制小鼠腸道菌群失調 低劑量穿心蓮內酯組、模型組與對照組比較，雙歧桿菌、乳酸桿菌含量均顯著降低，腸桿菌、腸球菌含量均顯著升高(P<0.05)；高劑量穿心蓮內酯組與對照組比較，雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌含量均無顯著差異(P>0.05)，高劑量穿心蓮內酯組、低劑量穿心蓮內酯組與模型組比較，雙歧桿菌、乳酸桿菌含量均顯著升高，腸桿菌、腸球菌含量均顯著降低(P<0.05)；高劑量穿心蓮內酯組與低劑量穿心蓮內酯組比較，雙歧桿菌、乳酸桿菌含量均顯著升高，腸桿菌、腸球菌含量均顯著降低，具有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 穿心蓮內酯改善氫化可的松誘導的免疫抑制小鼠腸道菌群失調

3 討 論

隨著我國中藥藥理研究的深入，穿心蓮已為我國中藥現代化的產業開發的重要產品〔8〕。早在10年前《美國草藥典》已對穿心蓮內酯等主要穿心蓮藥用成分做出規定，標志穿心蓮正式進入歐美市場〔9〕。機體的免疫系統包括特異性免疫和非特異性免疫，其中非特異性免疫是人類在長期的進化過程中建立起來的天然防御機制，其主要由機體屏障結構、吞噬細胞、體液中的抗微生物物質發揮功能〔10〕。機體內具有吞噬功能的細胞均稱為吞噬細胞，包括小吞噬細胞，即外周血中的中性粒細胞，大吞噬細胞，即血液中的單核細胞、組織中的巨噬細胞、單核細胞，其均對體內衰老死亡細胞和異物具有吞噬功能〔11〕。吞噬細胞實驗通常指大吞噬細胞的檢測實驗，判斷機體的非特異性免疫。早在2009年呂世明等〔12〕在研究呼吸道非特異性免疫中，用鼠傷寒沙門菌滴鼻建立小鼠肺損傷模型，通過對穿心蓮內酯處理小鼠的肺指數、吞噬細胞吞噬力、溶菌酶活性、T淋巴細胞活性綜合評分，揭示穿心蓮內酯可提高小鼠呼吸道非特異性免疫水平。由于穿心蓮的水溶性差，導致體外研究的結果不理想，但穿心蓮內酯的體內治療作用是公認的。早在1986年黃添友等〔13〕研究報道，穿心蓮內脂可使小鼠胸腺萎縮，外周血T淋巴細胞減少，降低腹腔滲出細胞(PFC)數和血清綿羊紅血球(SRBC)抗體效價及遲發型變態反應。20年后彭光勇等〔14〕發現，蓮必治注射液可提高豚鼠單核巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬率及人外周血中NK細胞殺傷K562細胞的活性，誘導人外周血單核細胞產生IFN-α、IFN-γ、TNF-α。江冬青等〔15〕在研究穿心蓮時也發現，中藥穿心蓮對人類的免疫功能具積極有影響。本研究檢測了穿心蓮治療的氫化可的松誘導的免疫抑制小鼠的脾臟胸腺指數和吞噬細胞吞噬能力發現，高劑量穿心蓮內酯可恢復小鼠吞噬細胞的吞噬能力至對照組水平，提示高劑量穿心蓮可明顯提高機體非特異性免疫，為穿心蓮內酯的用于臨床治療提供用藥參考。

腸道微生物是人類健康和疾病的重要決定因素，這些微生物分為兩類，即有害菌、有益菌〔16〕，其總體數量約為100萬億個細菌，包括30個屬的500多種菌。腸道菌大多為厭氧菌，其中雙歧桿菌和乳酸桿菌為腸道主要有益菌，與其他厭氧菌一起保持腸道正常微生態平衡〔17〕。當機體在環境污染、手術外傷、精神不佳、免疫抑制劑、抗癌劑等不利因素下會導致機體免疫力下降，使致病菌腸桿菌、腸球菌大量繁殖，雙歧桿菌、乳桿菌有益菌減少，造成腸道菌群紊亂，低機體天然免疫〔18〕。20世紀初，研究者發現，穿心蓮可改善草魚腸道菌群平衡〔19〕，可體外抑制銅綠假單胞菌系統使肝硬化大鼠腸道細菌感染患者受益〔20〕。Gao等〔21〕發現，穿心蓮模型的肺損傷脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠能夠明顯減輕。史艷平等〔22〕研究報道，炎琥寧注射液聯合思聯康應用，具有清熱燥濕、抗病毒、調節腸道菌群平衡的作用，對嬰兒病毒性腸炎具有較好的療效。本研究檢測了穿心蓮治療氫化可的松誘導的免疫抑制小鼠腸內容物中雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌含量與未處理小鼠比較發現，穿心蓮內酯可提高腸道菌群有益菌的含量，提示穿心蓮內酯具有改善腸道菌群作用。這些結果為穿心蓮內酯的臨床應用提供更充分的實驗數據支持。

綜上所述，穿心蓮內酯可提高機體免疫力，改善腸道菌群，這些發現將為中藥穿心蓮的臨床應用提供科學依據。