山茶籽對去卵巢大鼠血清護骨素和股骨骨組織的影響

顧建忠 李海 黃凌凌 陳建海 黎飚 楊潔 方曉燕

(右江民族醫學院組織學與胚胎學教研室，廣西 百色 533000)

Ⅰ型骨質疏松臨床上也叫絕經后骨質疏松(PMOP)，絕經后卵巢萎縮退化，女性激素分泌銳減，護骨素血液隨之下降，成骨細胞成骨功能得不到保護，反而破骨細胞功能亢進，引起溶骨大于成骨，導致總骨質量較少，骨質松散變脆，輕則腰酸背痛腿抽筋，重者骨折。臨床雌激素(E2)對PMOP防治效果較好，但令人擔憂是日益顯現的毒副作用〔1，2〕。本研究主要探討山茶籽對去卵巢大鼠血清護骨素和股骨組織的影響。

1 材料和方法

1.1材料 96只5月齡雌性SD大白鼠(300～350 g；SPF級)，榨油后的廣西百色市凌云山區的山茶籽剩余物：茶麩，茶麩經過石油醚進行3次重復脫脂，用濃度為95%的乙醇3次回流得到提取沉積物，并將提取物合并，并進行低溫濃縮至8.6 g/g生藥的濃度，濃縮乙醇提取物經過無菌處理后置于冰箱2～5℃密封狀態下保存備用。給實驗大鼠用藥再臨時加無菌生理鹽水配成5 g/g生藥濃度的大鼠灌胃液。苯甲酸注射E2針劑 (每支100 μg，浙江省仙居制藥有限公司，批號：20162086)。

1.2實驗動物大鼠分組 在去卵巢和假手術之前把96只實驗大鼠進行隨機分成4組，假去卵巢(Sham)組、去卵巢動物模型(OVX)組、去卵巢+苯甲酸注射E2(E2)組、去卵巢+山茶籽醇提物稀釋液(Ts)組，每組24只，分籠常規飼養，用標準規格飼料，飲水機自由給水。用藥后各組大鼠通風、照明、濕度、溫度和飼料各個飼養條件均相同。

1.3去卵巢動物模型建立 取OVX組、E2組、Ts組大鼠，配濃度為10 g/L戊巴比妥鈉麻醉液，按3.0 mg/kg劑量，局部消毒后腹腔注射，待大鼠進入麻醉狀態消毒條件下在背部雙切開進入腹腔，切去兩側卵巢，切口由內向外依次分層縫合。切除所得卵巢的組織學塊，經固定切片染色進行組織學鑒定確認。術后用注射卡那霉素液涂擦手術切口，連續3 d，避免手術切口化膿感染。術后1 w開始實驗用藥。Sham組操作方法和步驟同上，但不切去卵巢，只摘除貼附在卵巢的一近似卵巢大小塊的脂肪塊。術后用注射卡那霉素液涂擦手術切口，連續3 d，避免手術切口化膿感染。

1.4給藥方法 (1)Ts組：將8.6 g/g的山茶籽醇提物加無菌生理鹽水配成5 g/g生藥濃度的大鼠灌胃液，按10 ml/(kg·d)劑量進行灌胃。(2)E2組，E2 200 μg/kg，左右兩側大腿交替皮下注射，注射口按壓2 min，2次/w。(3)Sham組及OVX組，無菌生理鹽水灌胃，按10 ml/(kg·d)劑量進行灌胃。

1.5檢測指標及方法 各實驗動物組從第4周起，每隔4 w處死一批大鼠。即第4、8、12和16周每組取6只實驗大鼠，經腹腔注射濃度為10 g/L戊巴比妥鈉溶液，按3.0 mg/kg劑量，進行腹腔適度麻醉，經左心室取血完畢后再，常規處死。(1)各組大鼠右側股骨骨組織結構：分離右側股骨，取股骨頭1 cm，按常規骨組織制片過程：10%甲醛固定24 h、經酸溶液快速脫鈣、梯度酒精脫水、熱熔石蠟進行包埋，石蠟組織塊冷卻后進行切片，最后進行蘇木素-伊紅(HE)染色。放大200倍觀察各組光鏡骨組織結構；(2)各組大鼠左側股骨骨鈣：左側股骨頭剝離干凈周圍軟組織，并取近端1 cm。取左側的股骨頭集中放置瓷性烤盤，并置恒溫烤箱內，經105℃恒溫烤48 h直到恒重。北京愛尚陽光科技有限公司的十萬分之一實驗室分析天平稱其質量，將干骨置于坩堝進行炭化到無煙為止，把溫度降到600℃，保持恒溫1 h，加入20%的鹽酸(HCl)輕輕攪拌至完成溶解，再加入去離子水到需要容量刻度，用上海美譜達儀器有限公司的WFX-IE2型原子吸收分光光度計進行股骨頭骨鈣測定。(3)用骨鈣相同方法使股骨頭烘干脫水至恒重，稱其烘干股骨質量后，放入容量為10 ml的容器瓶中，注入20%的HCl于容器瓶中并封其口，把容器瓶放在恒溫烤箱中，110℃恒溫24 h，使股骨全部溶解。最后取出股骨容器瓶注入去離子水至相應容量刻度，用上海晶抗生物工程有限公司生產的磷試劑盒，上海光學儀器廠726型可見分光光度計測定股骨頭骨磷的含量。(4)各組大鼠血清護骨素：大鼠麻醉后切開胸腔用采血器穿刺左心室吸取心血5 ml，經過離心器以4 000 r/min進行10 min離心分離，沉淀獲取血清，置于低溫(-20℃)冰箱保存。用酶聯免疫吸附試驗按試劑盒操作說明測定血清護骨素。

1.6統計學處理 采用SSPS18.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1各組骨組織形態結構 Sham組骨組織骨質致密，骨皮質較厚，骨細胞規則密集，小梁粗且均勻，骨小梁排列有序，有明顯橫向連接。OVX組骨質薄，骨細胞稀少，骨小梁疏而細小、骨小梁斷裂、紊亂，骨小梁之間腔隙較大，骨質明顯疏松；E2組和Ts組與OVX組比較，骨皮質厚度和骨質密度明顯增加，疏松骨質病理改善顯著，骨質內部小梁較OVX組明顯增密、增粗，骨質之間腔隙變小而少。E2組和Ts組骨組織切片放大200倍光鏡下的結構形態相似。見圖1。

2.2各組骨鈣測量結果 OVX組在第4、8、12、16周采樣骨鈣顯著低于同時期其他3組，差異有統計學意義(P<0.01)；Ts組第4、8、12、16周骨鈣與同時期Sham組和E2組比較無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.3各組骨磷測量結果 OVX動物組在第4、8、12、16周骨磷明顯低于同時期其他3組(P<0.01)；Ts組第4、8、12、16周的骨磷與同時期Sham組和E2組比較無顯著差異(P>0.05)，見表1。

2.4各組血清護骨素檢測結果 OVX組在第4、8、12、16周血清護骨素顯著低于同時期其他3組(P<0.01)；Ts組第4、8、12、16周血清護骨素與同時期Sham組和E2組比較無顯著差異(P>0.05)。見表2。

組別骨鈣第4周第8周第12周第16周Sham組170.35±10.471)168.69±16.231)170.12±12.201)171.60±11.301)OVX組148.26±12.22147.53±8.60146.59±10.16147.68±11.51E2組166.50±12.091)169.16±16.201)169.28±12.231)172.18±13.121)Ts組 162.40±13.431)164.59±15.361)166.26±13.651)168.29±13.281)組別骨磷第4周第8周第12周第16周Sham組101.20±10.31)99.89±12.181)97.58±10.141)98.98±13.101)OVX組80.33±10.3279.89±10.1580.40±9.7278.12±10.12E2組102.33±12.301)99.32±13.081)98.38±11.281)98.10±10.121)Ts組 97.20±10.061)96.22±11.211)95.12±13.051)96.82±12.321)

與OVX組比較：1)P<0.05；表2同

表2 各組血清護骨素檢測結果

3 討 論

骨質內鈣化骨小梁多少用骨量表示，鈣化的骨基質把骨細胞之間各種纖維包含在其中，形成堅硬骨基質，當成骨細胞功能優于破骨細胞功能時，骨小梁粗而密，骨質結實而堅硬；當成骨細胞功能劣于破骨細胞功能時，骨小梁小而疏，骨質變脆易斷，也稱為骨質流失，導致骨質疏松。當卵巢功能正常時，足量女性雌激素水平維持成骨細胞正常功能〔3〕，而拮抗破骨細胞，成骨細胞功能大于破骨細胞功能，骨質生成與流失平衡，骨質保持正常〔4～7〕。絕經期女性，卵巢退化，卵巢功能下降，低量女性雌激素水平不維持成骨細胞功能，而拮抗不了破骨細胞，成骨細胞功能劣于破骨細胞功能，骨質生成量小于流失量，骨量自然減少，骨質出現疏松〔8，9〕。雌性SD大鼠去卵巢很好模擬絕經女性卵巢功能退化導致雌激素水平下降所致骨質疏松，所以出現OVX組的骨鈣、磷和血清護骨素明顯低于其他3組。股骨頭部骨質切片有顯著骨小梁變小，變疏松的病理改變〔10，11〕。本研究結果表明雌激素可以提高成骨細胞功能的成骨功能，拮抗雌激素減少引起骨質疏松，提高血鈣、磷和護骨素。也可能是雌激素通過增加護骨素，再通過護骨素提高成骨細胞的成骨功能，增加骨質生成，最終提高骨密度〔12，13〕。

本研究結果說明山茶籽醇提物有雌激素樣作用，屬于植物性雌激素。山茶籽醇提物可以提高護骨素，增加骨量，拮抗雌激素減少導致的骨質疏松〔14，15〕。如果進一步實驗證明山茶籽醇提物能防治PMOP，將為臨床防治PMOP提供實驗依據。如果臨床推廣山茶籽醇提物防治PMOP，可以大大減輕雌激素防治PMOP毒副作用，不僅提高患者生活質量，減輕社會和家庭負擔，也可以使廣大山區的山茶籽榨油后的茶麩充分利用，大大提高其經濟效益。