蒙藥巴特日七對小鼠膠質瘤的治療作用及可能機制

紅宇 王儒帥 趙盛 王睿君

(1內蒙古醫科大學附屬醫院影像診斷科，內蒙古 呼和浩特 010050；2內蒙古醫科大學研究生學院)

惡性膠質瘤發病快，70%～80%的患者多在發病半年之內確診〔1,2〕。隨著醫療技術及新藥研發加快，針對膠質瘤的治療手段取得較大進步，療效亦有明顯提升，但現實仍然面臨諸多挑戰，膠質瘤患者的預后和存活依然沒有得到顯著改善〔3〕，加強膠質瘤發病機制研究和治療方法探索顯得極為緊要，開發新的藥物用于治療膠質瘤對于提高患者療效和預后具有重要意義，蒙藥巴特日七又名為巴布敦朱日，是蒙醫臨床上治療黏熱癥及腸刺痛的最常用方劑。臨床研究表明巴特日七治療治療細菌性痢疾、扁桃體炎和銀屑病等疾病均有顯著的療效〔4,5〕，蒙藥巴特日七可明顯抑制胃癌MGC8023和結腸癌LOVO細胞作用〔6〕，本研究通過建立人膠質瘤移植瘤模型，探討蒙藥巴特日七對膠質瘤治療作用，并就其機制作初步探討。

1 材料與方法

1.1實驗材料 U251 膠質瘤細胞購自中國科學院上海生物學研究所。SPF 級雄性C57BL/6 小鼠，來源北京維通利華動物實驗中心。

1.2試劑 巴特日七味丸(內蒙古蒙藥股份有限公司)。胎牛血清購自Gibco公司，DMEM培養基、胰蛋白酶購自美國Invitrogen公司，PAMAM和FA購自美國Sigma公司。兔抗小鼠的高遷移率族蛋白(HMG)B1、Toll樣受體(TLR)4、核因子(NF)-κB和β-actin多克隆抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶耦聯山羊抗兔IgG 購自北京中杉金橋生物技術有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒、電光學發光(ECL)顯色試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。RIPA裂解液、Trizol 試劑盒、逆轉錄試劑盒購自天根生化科技北京有限公司)，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ購自寶日生物技術北京有限公司，引物由上海生工生物合成，Applied Biosystem 7500快速熒光定量PCR儀。垂直電泳槽和電轉儀購自北京六一儀器廠，水平搖床購自江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1小鼠膠質瘤模型構建 取對數生長期U251 細胞，胰蛋白酶消化，離心去上清，計算細胞數，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，置于37℃水浴備用。麻醉小鼠，將小鼠固定于立體定向儀上，剪去頭頂部眼裂至外耳道之間的毛發，常規消毒鋪單，于中線處眼裂后作一長約1.0 cm垂直切口，暴露前囟，取其前方1.0 mm，右側距中線1.0 mm處鉆孔，其直徑約為1.0 mm，用微量注射器吸取4 μl細胞懸液，調整移動架位置，使針尖位于骨孔處，緩慢垂直進針，持續注射10 min，緩慢拔針，以骨蠟封閉骨窗，逐層縫合關顱，固定于電極移動架上。正常飼養(57BL/6小鼠作為對照組)。

1.3.2治療方法 將模型分為四組：對照組注射無菌生理鹽水；低劑量治療組注射巴特日七味丸20 mg/kg；中劑量治療組注射巴特日七味丸40 mg/kg；高劑量治療組注射巴特日七味丸80 mg/kg，每組20只。每天灌胃給藥1次，每隔1 d測量腫瘤變化，治療12 d，脫臼處死，取腫瘤組織，并取出腫瘤稱重記錄，計算腫瘤體積，計算抑瘤率，體積抑瘤率(%)=(實驗組平均瘤體積/模型組平均瘤體積)×100%。腫瘤組織一部分用甲醛溶液保存，一部分放入液氮保存。本實驗經倫理委員會批準。

1.3.3腫瘤組織細胞凋亡情況 TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡情況，將制備好石蠟切片按試劑盒說明書進行操作，于光鏡下觀察，若細胞核內為棕黃色即為陽性細胞。隨機選擇并計算5個高倍視野中凋亡指數(AI)。AI=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%。

1.3.4Western印跡檢測HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白水平 解凍組織，加RIPA裂解液裂解，12 000 r/min，4℃，離心30 min，取上清。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，上樣50 g，根據濃度計算各個樣品所需體積，按1∶5加上樣緩沖液，隨后進行電泳，電泳完成后，切膠。隨后進行轉膜，200 mA，120 min。5%的脫脂牛奶封閉，室溫水平搖床2 h。用封閉液稀釋相應的HMGB1、TLR4和NF-κB一抗，使PVDF膜浸泡于TBST中，4℃孵育過夜。PBST洗3次，每次5 min，辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗按1∶50 000稀釋，孵育HRP標記的二抗，PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室溫搖床孵育2 h。TBST清洗PVDF膜3次，5 min/次。加入ECL底物液，孵育3 min。放入顯影液顯影、定影液定影。采用IMAJ軟件對目標圖像進行灰度值分析，并進行統計學分析。

1.3.5RT-qPCR檢測HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表達水平 解凍組織，用Trizol 試劑盒提取總RNA，均在冰上進行操作，檢測總RNA總RNA濃度。按照反轉錄試劑盒操作步驟,將RNA反轉錄為cDNA,以cDNA 為模板進行RT-qPCR 定量檢測。GAPDH 作為內參,引物序列：HMGB1正義鏈5'-GCGAGCATCCTGGCTTATC-3',HMGB1反義鏈5'-TTCAGCTTGGCAGCTTTCT-3';TLR4正義鏈5'-AGCAGGTGGAATTGTATCGC-3',TLR4反義鏈5'-TCAGGTCCAAGTTGCCGTTT-3';NF-κB正義鏈5'-GCATTCTGACCTTGCCTATCT-3',NF-κB反義鏈5'-CTCCAGTCTCCGAGTGAAGC-3';GAPDH正義鏈5'-ACCCCAGCAAGGACACTGAGCAAG-3',GAPDH反義鏈5'-GGCCCCTCCTGTTATTATGGGGGT-3'。反應體系為：主要混合物12.5 μl，正義鏈0.25 μl，反應鏈0.25 μl，模數2.5 μl，ddH2O加至20 μl，反應程序為預變性98℃,2 min;98℃變性30 s;60℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個循環，72℃，5 min。監測熒光信號,獲得相應Ct 值。每樣本設3次重復，計算平均Ct值，根據2-ΔΔCt法表示獲取mRNA相對表達水平。

1.4統計分析 采用SPSS22.0統計軟件進行t檢驗、方差分析及χ2檢驗。

2 結 果

2.1蒙藥巴特日七抑制腫瘤生長 治療12 d后，分析各劑量組的腫瘤抑制情況。與模型組比較，蒙藥巴特日七的抑制作用呈劑量依賴性關系(P<0.05)，見表1。

表1 腫瘤體積和抑制率

與模型組比較：1)P<0.05；與低劑量組比較：2)P<0.05；與中劑量組比較：3)P<0.05，下表同

2.2膠質瘤細胞凋亡指數 TUNEL法檢測結果顯示，模型組AI為〔(10.64±1.36)%〕，與對照組〔(41.25±5.16)%〕相比，明顯降低(P<0.05)，蒙藥巴特日七治療后，AI明顯增加，且隨著劑量的增加，AI增加越明顯〔低劑量組(18.13±2.29)%，中劑量組(25.36±3.15)%，高劑量組(33.52±4.28)%,P<0.05〕。

2.3HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達 Western印跡結果顯示，與模型組相比，蒙藥巴特日七治療后HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白明顯降低，且隨著劑量增加，蛋白減弱越明顯，呈現劑量效應關系(P<0.05)，見圖1，表2。

圖1 HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達

組別HMGB1TLR4NF-κB模型組0.98±0.050.89±0.051.47±0.11低劑量組0.76±0.031)0.67±0.041)1.19±0.091)中劑量組0.51±0.021)2)0.43±0.061)2)1.02±0.061)2)高劑量組0.22±0.031)2)3)0.19±0.021)2)3)0.45±0.031)2)3)

2.4HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表達 RT-qPCR結果結果顯示，與模型組相比，HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表達水平明顯增加(P<0.05)，蒙藥巴特日七治療后三種 mRNA明顯減弱，且隨著劑量增加， mRNA減弱越明顯，呈現劑量效應關系(P<0.05)，見表3。

表3 各組HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表達

3 討 論

膠質細胞瘤在手術中徹底切除腫瘤存在較大困難。故膠質瘤復發率高和預后較差。放化療法能夠殺死膠質瘤細胞，但其不具特異性，故會造成嚴重副反應，目前尚不明確發病機制，臨床上尚未具備根本治療的方法。因此，尋找新的有效的治療藥物仍然至關重要〔7,8〕。蒙藥治療腫瘤具有獨特優勢，用藥少，其療效好且安全性較高，且毒副作用低等優點，在抗腫瘤作用機制的研究逐漸成為醫學熱點。蒙藥巴特日七味丸具有清熱解毒、消黏的功效，為腸道及黏熱癥的常用主方，鄧秀玲〔9〕研究顯示蒙藥巴特日七能抑制MGC-803細胞的增殖。研究發現，蒙藥巴特日七味丸呈現劑量效應關系地抑制裸鼠移植瘤的生長〔10,11〕。腫瘤細胞之所以可無限增殖和生長，最重要的是細胞凋亡機制明顯異常。HMGB1 屬于一種染色質非組蛋白核蛋白〔12〕，細胞外的HMGB1可結合其受體TLR4激活細胞NF-κB通路，參與調節腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移。有研究報道膠質瘤患者腫瘤組織中HMGB1、TLR4均與病理特征密切相關，HMGB1/TLR4/NF-κB可能直接參與膠質瘤的發病〔13,14〕。本研究提示蒙藥巴特日七味丸可能通過調控HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路抑制膠質瘤。