下調BAP31基因表達抑制結直腸癌細胞增殖侵襲及Wnt/β-catenin信號

李玉山 孫建明 李菊蘭

(1武威市中醫院，甘肅 武威 733000；2武威市涼州區西關街社區衛生服務中心)

結直腸癌的發生發展過程復雜，涉及基因表達過度、基因突變等〔1，2〕。B細胞受體相關蛋白(BAP)31基因定位于Xq28，屬于BAP家族成員之一，在1994年被首次鑒定，是內質網上不可缺少的跨膜蛋白，在進化上保守，且在各個組織表達廣泛，以往研究發現，BAP31可介導小細胞小泡蛋白、主要組織相容性復合體(MHC)-Ⅰ等分子離開內質網以囊泡形式向其他細胞器運輸〔3〕；也可參與細胞凋亡的調節〔4〕。近些年的研究發現，不同組織中BAP31表達水平并不相同，在人體正常組織低表達或不表達(除睪丸組織外)，大多數惡性黑色素瘤BAP31高表達，可能是該病免疫治療的靶點〔5〕。結直腸癌細胞中BAP31表達明顯高于結腸上皮細胞，miR-451a調控BAP31誘導結直腸癌細胞凋亡〔6〕。BAP31對結直腸癌細胞增殖侵襲的影響及機制研究的尚未明確。本研究通過RNA干擾技術抑制結直腸癌細胞BAP31表達，觀察細胞的增殖及侵襲能力，并進一步研究其作用機制。

1 材料方法

1.1主要試劑和儀器 RPMI1640培養基、胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco；細胞計數試劑盒(CCK)8試劑盒購自日本同仁公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所；Transwell侵襲小室購自美國Corning公司；BAP31、β-catenin、增殖細胞核抗原(PCNA)、基質金屬蛋白酶(MMP)-2和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購自美國Abcam；LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen；酶標儀購自美國Thermo。

1.2細胞及培養 正常結腸上皮細胞NCM460及結直腸癌DLD-1，HT29，SW620和 HCT116細胞均購自美國ATCC。細胞在含10%FBS的RPMI1640培養液中，于37℃、5%體積分數CO2培養箱中常規培養傳代。實驗為生長至對數期的細胞。

1.3Western印跡 RIPA裂解液適量提取細胞總蛋白，BCA法測定樣品蛋白濃度，每孔30 μg上樣蛋白，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白分離后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，以5%的脫脂奶粉封閉轉好的膜1 h，洗膜，加BAP31、β-catenin、PCNA、MMP-2和內參GAPDH抗體(皆為1∶1 000稀釋)，4℃搖床孵育過夜，洗膜，加已配置好的1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫搖床孵育1 h，增強化學發光法(ECL)顯色，顯影、定影。以目的蛋白與GAPDH灰度值比值為各蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.4siRNA轉染 根據GeneBank中提供的BAP31基因的cDNA序列，依據siRNA設計原則，設計針對BAP31的特異性siRNA及陰性對照siRNA，分別命名為si-BAP31組和NC組，由上海吉瑪合成純化。轉染前1 d接種 HCT116細胞于6孔板，密度為1×105個/孔，觀察到細胞生長融合達80%～90%時，參照LipofectamineTM2000說明，制備siRNA-Lip2000混合物，并將混合物加入至6孔板，同時設置空白對照組，僅加入脂質體，于培養箱內孵育5～6 h，更換為含血清及抗生素的培養基，繼續培養48 h。收集細胞，用于后續實驗研究。

1.5CCK8法檢測細胞活力 取生長至對數期的HCT116細胞，胰酶消化后以5×103個/孔接種于96孔板，每孔200 μl，于培養箱內常規培養24 h，轉染si-BAP31和NC，并設置空白對照組，每組設置5個復孔，分別收集轉染后24、48和72 h的細胞，加入CCK8試劑，每孔10 μl，37℃孵箱1.5 h后于450 nm處使用酶標儀測定吸光度值(A值)。實驗重復3次。

1.6Transwell小室檢測細胞侵襲能力 Matrigel膠鋪在Transwell小室的上室面，室溫風干。取生長至對數期的HCT116細胞，參照1.4分組及轉染方法制備成不含血清的單細胞懸液100 μl(約1×105個細胞)，加入到Transwell小室的上室內，下室加入含FBS的RPMI1640培養液600 μl，培養箱內常規培養，48 h后，取出小室，4%的多聚甲醛固定20 min，0.1%的結晶紫染色20 min，棉簽輕輕擦拭干凈小室內的細胞，隨機選擇5個視野，倒置顯微鏡觀察穿膜細胞數，取均值，實驗重復3次。

1.7統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行方差分析，SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1BAP31在結直腸癌細胞表達 以正常結腸上皮細胞NCM460為對照細胞，Western印跡檢測結直腸癌DLD-1，HT29，SW620和 HCT116細胞中BAP31的蛋白表達(0.232±0.025、0.316±0.030、0.278±0.029、0.488±0.051)均顯著高于在NCM460細胞的表達(0.078±0.008，P<0.05)。見圖1。

圖1 BAP31在結直腸癌細胞表達

2.2si-BAP31轉染HCT116細胞效果 si-BAP31組BAP31表達(0.108±0.011)顯著低于空白對照組(0.658±0.052，P<0.05)，NC組BAP31表達(0.669±0.055)與空白對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 si-BAP31轉染的HCT116細胞BAP31的蛋白表達

2.3si-BAP31轉染抑制HCT116細胞活力 與NC組比較，si-BAP31組在24、48和72 h的細胞活力均顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 si-BAP31對HCT116細胞活力的影響

與NC組比較：1)P<0.05，下表同

2.4si-BAP31轉染抑制HCT116細胞侵襲能力 空白對照組穿膜細胞數(202.4±7.1)個、NC組(198.9±6.7)個、si-BAP31組(116.5±3.2)個。與NC組比較，si-BAP31組細胞侵襲能力顯著降低(P<0.05)。

2.5si-BAP31轉染抑制HCT116細胞Wnt/β-catenin信號通路 與NC組比較，si-BAP31組β-catenin、PCNA和MMP-2的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。見圖3，表2。

圖3 si-BAP31轉染對HCT116細胞β-catenin、PCNA和MMP-2蛋白表達的影響

組別β-cateninPCNAMMP-2空白對照組0.572±0.0460.188±0.0200.162±0.017NC組0.591±0.0500.196±0.0230.157±0.015si-BAP31組0.142±0.0161)0.102±0.0101)0.082±0.0901)

3 討 論

BAP31在進化上高度保守，在哺乳動物的細胞中廣泛存在，參與新生蛋白內質網生產和分泌過程〔7〕。有研究表明，結直腸癌DLD-1，HT29，SW620和 HCT116細胞中BAP31表達明顯高于結腸上皮細胞，且在HCT116細胞表達最高〔6〕，本研究結果與前人〔6〕一致。因此，選擇HCT116細胞為研究對象。RNA干擾(RNAi)是近些年發展起來的一種在轉錄后阻斷基因表達的新技術，能特異性、高效性的抑制基因表達，與其他基因阻斷技術比較有更多的優勢，目前已廣泛應用于腫瘤治療、基因功能研究等方面〔8,9〕。有研究表明，抑制宮頸癌中BAP31表達能降低細胞增殖、侵襲和遷移能力，并阻滯細胞于G0/G1期〔10〕。BAP31對結直腸癌細胞增殖侵襲的影響尚未明確。本研究表明BAP31表達參與結直腸癌的侵襲過程。腫瘤的侵襲轉移對患者的預后造成嚴重的影響，明確腫瘤侵襲轉移機制，并探究抑制機制將為腫瘤患者帶來福音。Wnt/β-catenin是Wnt信號通路中的經典信號途徑，參與細胞的增殖、凋亡等過程，多種腫瘤中處于激活狀態，其激活可導致腫瘤發生〔11～13〕。β-catenin為Wnt/β-catenin信號的關鍵分子，可通過與細胞膜上的鈣黏蛋白和細胞骨架結合發揮細胞結構維持及黏附作用。結直腸癌組織中β-catenin異常堆積，而β-catenin的過表達與腫瘤浸潤深度及局部去分化有關〔14〕。也有研究表明，抑制β-catenin表達可降低結直腸癌發生發展〔15〕。腫瘤細胞侵襲轉移能力與蛋白酶降解ECM、基底膜能力密切相關。MMPs是一組重要的蛋白酶，在腫瘤侵襲及轉移過程中發揮重要作用，MMP-2為MMPs家族成員之一，在包括結直腸癌在內的多種腫瘤中表達升高，而抑制其表達可降低癌細胞的侵襲及遷移能力〔16,17〕。PCNA是合成DNA不可缺少的因子，其表達水平可反應出細胞的增殖狀態，目前已作為細胞增殖活性檢測的指標〔18〕。本研究結果提示BAP31抑制結直腸癌增殖侵襲的機制可能通過下調Wnt/β-catenin信號途徑。