亞甲酰胺異羥肟酸聯合索拉非尼對肝癌細胞遷移與侵襲的影響

郝大林 孫成學 肖福斌 鄧放

(北華大學附屬醫院 1感染肝病科，吉林 吉林 132011； 2肝膽胰外科)

手術治療是首選的肝癌治療方案，但由于肝癌的早期病變惡性程度高、發病隱匿、診斷率低，使得很多患者喪失了手術治療的機會〔1〕。因此，研究肝癌的其他有效治療手段是當務之急。組蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制劑(HDACI)亞甲酰胺異羥肟酸(SAHA)和索拉非尼(SRFN)是臨床上常用的治療肝癌的藥物，主要用于一些無法通過手術治療的肝癌患者〔2〕。聯合應用SAHA和SRFN可以提高療效，減少毒副作用，達到綜合治療肝細胞癌(HCC)的效果〔3〕。本實驗擬探討SAHA與SRFN協同作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1細胞培養與分組 HepG2 細胞株(購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫)放置于 37℃、二氧化碳濃度為5%的孵育箱中進行培養。培養基的組成成分為含 10%滅活小牛血清的 RPMI1640 及含 1%的青霉素與鏈霉素雙抗。細胞為上皮樣細胞，傳代頻率為2～3 d/次，取對數生長期的細胞為研究樣本。分為對照組(未處理)、SAHA(1.5 μmol/L SAHA處理)、SRFN(1.5 μmol/L SRFN處理)和SAHA聯合SRFN組(1.5 μmol/L SAHA和1.5 μmol/L SAHA處理)。

1.2劃痕法檢測細胞侵襲 將5×105個細胞懸液均勻接種于6孔細胞培養板，用上述藥物處理24 h后，垂直使用10 μl的吸管尖端，產生細胞單層的劃痕。棄去舊培養液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，去除劃痕細胞，加入新的培養液。倒置顯微鏡下觀察劃痕寬度及細胞密度比較一致的部分做標記，分別在不同時間點拍照測量劃痕寬度并觀察劃痕的愈合速度。

1.3Transwell法檢測細胞遷移 將無胎牛血清(FBS)的DMEM(1∶3)以60 μl/室加入Transwells頂腔，常溫放置2 h，在無血清DMEM中培養對數生長期細胞24 h，制成密度為1×105細胞/ml的細胞懸液。將200 μl的細胞懸浮液加入Matlab涂覆的頂層室中。將插入物放入含有500 μl DMEM、10%FBS的24孔板的底部室孔中培養24 h。將細胞固定在4%甲醛中15 min，然后用0.25%的結晶紫染色25 min，在空氣干燥前用無菌水沖洗插入物。無菌工作臺空氣干燥后，拍攝細胞膜，測定細胞計數。

1.4Western印跡檢測不同處理組細胞中蛋白水平 用SAHA、SRFN或SAHA聯合SRFN處理后，以細胞總蛋白提取試劑盒提取HepG2細胞的總蛋白。用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒測定蛋白質濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白(100 μg)轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。硝酸纖維素膜依次經過封閉、一抗孵育、洗膜、辣根過氧化物酶耦聯的二抗孵育、洗膜，最后采用化學發光顯色試劑顯影并攝像。

1.5統計分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1SAHA、SRFN或SAHA聯合SRFN對HepG2細胞侵襲的影響 與對照組(100.0%)相比，SAHA、SRFN、SAHA聯合SRFN組侵襲能力分別為69.0%、47.8%和15.0%，見圖1。

圖1 各組HepG2細胞侵襲(×10)

2.2SAHA、SRFN或SAHA聯合SRFN對HepG2細胞遷移的影響 與對照組(100.0%)相比，SAHA、SRFN、SAHA聯合SRFN組遷移能力分別為56.0%、47.0%和3.5%，處理不同時間的劃痕試驗結果見圖2。

圖2 各組不同處理時間HepG2細胞遷移(×10)

2.3SAHA、SRFN或SAHA聯合SRFN對HepG2細胞相關蛋白表達的影響 與對照組相比，SAHA或SRFN顯著上調E-cadherin蛋白的表達(P<0.05)。SAHA聯合SRFN組E-cadherin蛋白表達顯著高于SAHA或SRFN組(P<0.05)。SAHA或SRFN顯著下調MMP-2、Vimentin的表達(P<0.05)，而對MMP-9蛋白表達無明顯影響。SAHA聯合SRFN組MMP-2和Vimentin的表達顯著低于SAHA或SRFN組(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組HepG2細胞相關蛋白表達

3 討 論

HDACI通過抑制HDAC活性、調節組蛋白乙酰化狀態、促進抗腫瘤轉錄因子的轉錄和表達、調節相關信號通路發揮抗腫瘤生物學效應〔4〕。SAHA是最具代表性的HDACI之一，它通過抑制腫瘤細胞核酸、染色質的組蛋白乙酰化狀態，進而抑制其增殖、分化功能發揮作用。研究顯示，SAHA通過調節基因，提高腫瘤細胞對其他化療的敏感性，達到治療癌癥的目的〔3〕。盡管SAHA和SRFN的作用靶點不同，但腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲和遷移受DNA調控，說明兩者聯合可能具有協同抗腫瘤作用。SAHA聯合SRFN對HepG2遷移和侵襲的抑制作用明顯強于SAHA和SRFN。Cha等〔5〕研究不同抗腫瘤藥物作用靶點不同，但均通過誘導腫瘤細胞凋亡和改變腫瘤組織內環境而顯示出抗腫瘤活性。細胞周期阻滯與細胞凋亡間有重要聯系。

本研究還發現SAHA聯合SRFN對HepG2細胞的侵襲和遷移的抑制作用比SAHA和SRFN單獨作用要強。腫瘤細胞的侵襲和遷移能力在促進原發腫瘤疾病進展中起著重要作用，而降低腫瘤細胞的侵襲和遷移能力是抗腫瘤藥物抑制腫瘤疾病進展的重要方面。腫瘤細胞的上皮-間充質轉化(EMT)可增強其侵襲和遷移能力，可導致腫瘤進一步惡化〔6〕。MMP-2、MMP-9、vimentin和E-cadherin是EMT的重要標志蛋白〔7〕。MMP-2和MMP-9蛋白是MMP家族的兩個重要成員，另有研究表明MMP是EMT過程中最重要的蛋白水解酶。MMP-2和MMP-9在肺癌細胞的EMT過程中表達顯著上調，與肺癌細胞的侵襲和遷移能力有關〔8〕，Yang等〔9〕還發現MMP-2的表達與肝癌細胞遷移能力呈正相關。然而，vimentin蛋白被認為是EMT過程中發揮作用的一個重要蛋白。Ulirsch等〔10〕發現vimentin蛋白能促進乳腺癌細胞的遷移和轉移。E-cadherin在腫瘤細胞的EMT過程中與MMPs和波形蛋白有相反的作用。E-cadherin是EMT過程中的一種上皮性標志物，可抑制腫瘤細胞的遷移，E-cadherin蛋白表達上調表明腫瘤細胞的遷移和侵襲能力增強。本研究發現相對于SAHA和SRFN的表達，SAHA聯合SRFN顯著下調MMP-2和vimentin蛋白的表達，上調E-cadherin蛋白，表明這是SAHA和SRFN聯合用藥抗侵襲和遷移的分子機制。同時，SAHA和SRFN之間存在協同和疊加效應。