姜黃素通過上調miR-15a/16表達抑制人非小細胞肺癌A549細胞增殖促進細胞凋亡的機制

秦芳 秦淑英 王新森 劉文玉 李偉偉

(1安陽職業技術學院講師，河南 安陽 455000；2安陽市腫瘤醫院放射二科；3濮陽市安陽地區醫院普外科；4新鄉醫學院第一附屬醫院腫瘤二科)

非小細胞肺癌是肺癌導致的相關性死亡的首要原因，手術治療、放療和化療等是其常用的治療手段，但效果均不太理想。姜黃素是一種來自姜科植物姜黃等根莖的酚性色素，因其具有毒副作用小和抗癌譜廣等優勢一直備受腫瘤界學者們的青睞〔1～3〕。有研究〔4，5〕發現，姜黃素可通過上調(miR-15a/16)發揮促乳腺癌凋亡和抗白血病細胞增殖的作用。已研究〔6～8〕證實，miR-15a/16在非小細胞肺癌組織中低表達，并且姜黃素可抑制非小細胞肺癌A549細胞的增殖，并誘導細胞凋亡，但姜黃素的抗腫瘤作用是否通過調控miR-15a/16表達來執行尚不清楚。本研究旨在探討miR-15a/16在姜黃素抑制人非小細胞肺癌A549細胞增殖及促凋亡過程中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1試劑 杜爾貝科改良伊格爾培養基(DMEM)培養基、胎牛血清和胰蛋白酶購于美國GIBCO公司，姜黃素和噻唑藍(MTT)試劑購于美國Sigma公司，Trizol和Lipofectamine2000購于美國Invitrogen公司，miR-15a/16模擬物及對照、miR-15a/16抑制劑及對照購于美國RiboBio公司，雙熒光素酶報告質粒購于上海吉瑪公司，細胞周期蛋白(CyclinD1)抗體、B淋巴細胞瘤(BCL)2抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體和辣根過氧化氫酶標記的二抗均購于美國Santa Cruz公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜購于美國Pall公司，總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、總蛋白提取試劑盒、TUNEL-DAPI雙染試劑盒和Caspase 3活性檢測試劑盒均購于上海碧云天生物技術研究所，雙熒光素酶活性檢測試劑盒購于美國Promega公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 A549細胞購于中國科學院細胞庫，采用DMEM培養基(含10%胎牛血清)于培養條件為飽和濕度、5%CO2和37℃細胞培養箱內常規培養。待A549細胞匯合度達85%以上時，以0.25%胰蛋白酶消化，按照1∶3比例傳代。收集長勢良好的第4代對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖 將A549細胞以每孔200 μl(濃度為6×105個/ml)接種于96孔細胞板上，于培養箱中貼壁培養過夜后，加入終濃度分別為0.0、12.5、25.0、50.0 μmol/L姜黃素處理A549細胞，并標記為對照組(0.0 μmol/L姜黃素)、姜黃素12.5 μmol/L組、姜黃素25.0 μmol/L組和姜黃素50.0 μmol/L組，每個處理組設置6個平行孔。于培養箱內孵育48 h后，加入40 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液，孵育4 h。棄上清后，加入200 μl的二甲基亞砜，震蕩反應10 min。待紫色結晶充分溶解后，選取490 nm波長，以酶聯免疫檢測儀檢測各孔細胞的光密度值(A)。根據細胞存活率=100%×(處理組A/對照組A)計算各處理組細胞的細胞存活率。實驗重復3次，取均值。

1.2.3Caspase3活性檢測 收集以0.0、12.5、25.0、50.0 μmol/L姜黃素處理48 h后A549細胞，以1 000 r/min離心棄上清后，加入細胞裂解液，參照Caspase3活性檢測試劑盒操作步驟檢測各濃度姜黃素處理下A549細胞的Caspase3活性。

1.2.4RT-PCR檢測miR-15a/16表達 經0.0、12.5、25.0、50.0 μmol/L姜黃素處理48 h后，收集A549細胞，以總RNA提取試劑盒獲取總RNA，并以1 μg總RNA為模板，采用逆轉錄試劑盒合成cDNA。以4.0 μl cDNA、各1.0 μl濃度為10 μmol/L的正反引物、1 μl ROX Reference Dye Ⅱ、25 μl 2×SYBR Premix Ex Taq和18 μl ddH2O配成50 μl反應體系，進行PCR擴增：94℃ 預變性 5 min，1個循環；95℃變性 15 s、58℃ 退火30 s、72℃ 延伸30 s，40個循環；以U6為內參，2-△△Ct法檢測不同濃度姜黃素處理下A549細胞中miR-15a/16的相對表達量。PCR擴增引物由上海生工生物合成，各基因引物序列：miR-15a：上游：5′-GCGGTAGCAGCACATAATG-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-16：上游：5′-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3′，下游：5′-C-CAAUAUUUACGUGCUGCUAUU-3′；U6：上游：5′-CT-CGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACG-AATTTGCGT-3′。

1.2.5細胞轉染 取對數生長期的A549細胞，以200 μl(濃度為6×105個/ml)接種至6孔細胞板上，于細胞培養箱中培養過夜。待細胞密度達70%以上時，開始進行瞬時轉染。將細胞分為對照組(未處理)、姜黃素組(給予50 μmol/L姜黃素)、anti-NC+姜黃素組(轉染抑制劑陰性對照后，給予姜黃素處理)、anti-miR-15a+姜黃素組(轉染miR-15a抑制劑后給予姜黃素處理)；anti-miR-16+姜黃素組(轉染miR-16抑制劑后給予姜黃素處理)。根據Lipofectamine2000說明書步驟將抑制劑陰性對照、miR-15a抑制劑和miR-16抑制劑分別轉染至A549細胞中。待轉染24 h后，加入濃度為50 μmol/L姜黃素處理48 h。并設置未經轉染也未經姜黃素處理的對照組和未經轉染只給予50 μmol/L姜黃素處理的姜黃素組。采用RT-PCR檢測各處理組中miR-15a和miR-16的相對表達量。MTT法檢測各組細胞的活力。具體步驟參照1.2.4和1.2.2。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞周期 收集上述瞬時轉染miR-15a抑制劑、miR-16抑制劑和陰性對照并給予姜黃素處理的各組細胞及對照組和姜黃素組的細胞，以磷酸緩沖液洗滌后，1 000 r/min離心棄上清。加入預冷的乙醇(濃度為70%)于4℃下對細胞進行固定。離心后，以胰蛋白酶消化，加碘化丙啶染色后，上流式細胞儀進行檢測。實驗重復3次。

1.2.7TUNEL-DAPI雙染檢測細胞凋亡 以適當密度將對數生長期的A549細胞接種6孔細胞板(放有無菌蓋玻片)，培養至細胞貼壁后，按照1.2.5中的方法轉染和給予姜黃素處理后，離心棄培養液，在20℃條件下以濃度為4%甲醛對各處理組細胞進行固定。固定結束后，用磷酸緩沖液洗滌細胞。參照TUNEL-DAPI雙染試劑盒說明書步驟，加入TUNEL反應液，并以3%H2O2充分固定。磷酸緩沖液洗滌后，加入0.1% TritonX-100于4℃下充分反應。再次洗滌后，于37℃下避光加入TUNEL反應液作用1 h后，加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)染色。采用熒光顯微鏡檢測400倍視野下細胞的凋亡情況，并拍照。

1.2.8雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-15a/16靶基因 Targetscan軟件預測發現miR-15a和miR-16均與CyclinD1和BCL2 的3′-非編碼區(UTR)存在結合位點。為了驗證miR-15a和miR-16與CyclinD1和BCL2是否存在靶向關系，取對數生長期的A549細胞，以適當密度接種至24孔板上，于培養箱內常規培養24 h后，將細胞分為陰性對照組+CyclinD1野生型(BCL2野生型)，miR-15a模擬物(miR-16模擬物)+CyclinD1野生型(BCL2野生型)，anti-NC+CyclinD1野生型(BCL2野生型)，anti-miR-15a(anti-miR-16)+CyclinD1野生型(BCL2野生型)。按照Lipofectamine 2000說明書步驟分別轉染CyclinD1野生型(BCL2野生型)報告質粒分別與miR-15a模擬物(miR-16模擬物)或miR-15a抑制劑(miR-16抑制劑)、模擬物陰性對照或抑制劑陰性對照進行共轉染，實驗設置3個重復。轉染48 h后，根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組細胞中雙熒光素酶的活性。其中，將陰性對照組的熒光素酶活性設為1，并以海腎熒光素酶活性作內參對目的基因的熒光素酶活性進行標化。

1.2.9Western印跡檢測CyclinD1和BCL2蛋白表達 A549細胞處理后，參照總蛋白提取試劑盒提取各處理組細胞中的總蛋白，并采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒測定蛋白的濃度。取蛋白樣品80 μg，加入等體積上樣緩沖液，于沸水浴中變性3～5 min。上樣至十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠中電泳分離后，采用濕轉儀進行轉膜。轉PVDF膜結束后，放入含5%的脫脂牛奶的封閉液中處理2 h。CyclinD1一抗的稀釋比例為1∶800，BCL2和GAPDH一抗的稀釋比例均為1∶1 000。 4℃下，將封閉后的PVDF膜與一抗反應24 h后，于37℃下加入1∶2 000倍稀釋的二抗，震蕩反應2 h后，加入化學發光劑顯影曝光，凝膠成像系統掃描分析。

1.3統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析，兩組間比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1姜黃素抑制A549細胞增殖促進細胞凋亡 以0.0、12.5、25.0和50.0 μmol/L姜黃素處理48 h后，MTT檢測發現A549細胞的存活率依次降低，姜黃素能夠呈濃度依賴地抑制A549細胞增殖(P<0.05)。進一步檢測凋亡相關指標Caspase3活性發現，12.5、25.0和50.0 μmol/L姜黃素作用后，A549細胞的Caspase3活性較對照組均明顯升高，姜黃素能夠呈濃度依賴地誘導A549細胞中Caspase3活性增加(P<0.05)。見表1。

表1 姜黃素對A549細胞活力和Caspase3活性的影響

與對照組比較：1)P<0.05，表2同

2.2姜黃素呈濃度依賴地誘導A549細胞中miR-15a/16的表達 RT-PCR檢測0、12.5、25和50 μM姜黃素處理48 h后A549細胞中miR-15a/16的相對表達量依次升高。與對照組相比，miR-15a/miR-16的表達水平差異均有統計學意義(P<0.05)，且表現出一定的姜黃素濃度依賴性。見表2。

表2 姜黃素對A549細胞中miR-15a/16表達的影響

2.3下調miR-15a/16可逆轉姜黃素對A549細胞增殖的抑制 姜黃素處理后A549細胞中miR-15a和miR-16的表達水平較對照組均明顯升高(P<0.05)，轉染陰性對照未能改變姜黃素誘導的miR-15a和miR-16的表達(P>0.05)，但轉染miR-15a和miR-16抑制劑后，姜黃素誘導的miR-15a和miR-16的表達均明顯受到抑制(P<0.05)。MTT檢測發現，姜黃素處理后A549細胞存活率較對照組明顯減弱(P<0.05)，轉染陰性對照對姜黃素處理下A549細胞存活率無顯著影響(P>0.05)，而轉染miR-15a和miR-16抑制劑后，能夠明顯逆轉姜黃素對A549細胞增殖的抑制(P<0.05)。流式細胞儀檢測發現，與對照組相比，姜黃素能夠使A549細胞在G1期所占比例明顯升高(P<0.05)，而S期所占比例明顯降低(P<0.05)；轉染陰性對照不影響上述姜黃素對A549細胞的作用(P>0.05)，而miR-15a和miR-16抑制劑能夠明顯逆轉姜黃素引起的G1期比例明顯降低、S期比例明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 下調miR-15a/16對姜黃素作用下A549細胞增殖的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與anti-NC+姜黃素組比較：2)P<0.05

2.4下調miR-15a/16可逆轉姜黃素對A549細胞凋亡的誘導作用 TUNEL-DAPI雙染色結果發現，姜黃素處理后，TUNEL陽性細胞比例較對照組明顯升高(P<0.05)；轉染陰性對照后，TUNEL陽性細胞比例與姜黃素處理組無明顯差異(P>0.05)，而轉染miR-15a和miR-16抑制劑后，TUNEL陽性細胞比例較姜黃素處理組明顯降低(P<0.05)。進一步檢測各處理組中Caspase3相對活性發現，姜黃素處理后A549細胞中Caspase3活性較對照組明顯升高(P<0.05)，轉染陰性對照未能改變姜黃素對Caspase3活性的影響(P>0.05)，但轉染miR-15a和miR-16抑制劑后，姜黃素誘導的Caspase3活性明顯受到抑制(P<0.05)。見圖1、表4。

圖1 下調miR-15a/16對姜黃素誘導的A549細胞凋亡的影響(×200)

表4 下調miR-15a/16對姜黃素誘導的A549細胞凋亡的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與anti-NC+姜黃素組比較：2)P<0.05

2.5CyclinD1和BCL2是miR-15a/16的靶標 利用Targetscan軟件預測發現CyclinD1和BCL2的3′-UTR中含有與miR-15a/16互補的核苷酸序列，見圖2A。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，轉染miR-15a模擬物后，CyclinD1和BCL2的熒光素酶活性與相應的陰性對照相比均明顯降低(P<0.05)；同時轉染miR-16模擬物后，CyclinD1和BCL2的熒光素酶活性也明顯降低(P<0.05)。反之，轉染miR-15a抑制劑后，CyclinD1和BCL2的熒光素酶活性明顯升高(P<0.05)；轉染miR-16抑制劑后，與轉染miR-15a抑制劑的結果相一致，CyclinD1和BCL2的熒光素酶活性均顯著升高(P<0.05)。進一步檢測CyclinD1和BCL2蛋白表達的表達發現，與陰性對照相比，轉染miR-15a模擬物能夠顯著下調CyclinD1和BCL2蛋白表達(P<0.05)；反之則上調CyclinD1和BCL2表達(P<0.05)；同時，轉染miR-16模擬物后CyclinD1和BCL2蛋白的表達也顯著下降，反之則明顯升高(P<0.05)。見圖2B和表5、6。

1～6：陰性對照組、miR-15a組、miR-16組、anti-NC組、anti-miR-15a組、anti-miR-16組圖2 miR-15a/16與靶基因CyclinD1和BCL2的結合位點及對靶基因蛋白表達的影響

組別CyclinD1BCL2陰性對照組1.00±0.081.00±0.11miR-15a組0.36±0.041)0.38±0.041)miR-16組0.41±0.041)0.42±0.041)anti-NC組1.06±0.090.98±0.10anti-miR-15a組2.15±0.222)1.98±0.192)anti-miR-16組 2.32±0.242)2.01±0.212)F/P值103.155/0.00088.819/0.000

與陰性對照組比較：1)P<0.05；與anti-NC組比較：2)P<0.05；下表同

表6 miR-15a/16對蛋白表達的影響

3 討 論

肺癌是導致人類癌癥死亡的重要原因，而非小細胞肺癌約占肺癌的85%。miRNAs是一類在機體生長發育、細胞生物學過程和應激反應等中發揮重要作用的非編碼RNA，大量研究〔9～11〕證實，非小細胞肺癌的發生發展與miRNAs的異常表達及調控關系密切。miR-15a和miR-16作為miRNAs中的重要成員，在卵巢癌、慢性淋巴細胞白血病和前列腺癌等多種腫瘤組織或細胞中異常低表達，是腫瘤診斷和治療的分子標記物和靶基因〔12～14〕。在多發性骨髓瘤中，下調miR-15a/16可通過增強CABIN1表達促進腫瘤細胞的增殖〔15〕；而上調miR-15a/16表達可促進人骨肉瘤SOSP-9607細胞凋亡并抑制細胞增殖〔16〕。另外，miR-15a/16的過度表除了抑制了人宮頸癌HeLa細胞的增殖和誘導G1/S細胞周期轉變外，還能夠顯著增強了抗癌藥物喜樹堿誘導的HeLa細胞自噬和凋亡〔17〕。此外，具有抗腫瘤作用的白藜蘆醇和野黃芩苷等均能夠通過上調miR-15a/16的表達發揮抑制腫瘤細胞的增殖和誘導癌細胞凋亡的作用〔18，19〕。姜黃素是一種研究較多的抗腫瘤藥物，其對非小細胞肺癌的進展具有較好的抑制作用，但其抗非小細胞肺癌的機制并不完全清楚〔20〕。有報道〔4，5〕顯示，姜黃素可通過上調miR-15a和miR-16表達促進乳腺癌凋亡和抑制白血病細胞增殖，但其抗非小細胞肺癌是否通過上調miR-15a/16表達來執行并不清楚。本研究結果表明，CyclinD1和BCL2是miR-15a/16的靶基因。這一結果與Cai等〔21〕和Zhang等〔22〕報道的miR-15a/16通過直接結合CyclinD1 和BCL2 3′-UTR抑制CCND1和BCL2的轉錄，進而誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯的結果相吻合。綜上，姜黃素是一種很有潛力的抗非小細胞肺癌的藥物，其通過上調miR-15a/16表達來發揮抗腫瘤的活性可能是其重要的途徑之一，miR-15a/16有望成為非小細胞肺癌治療的重要靶基因。