生命早期鐵缺乏誘發大鼠成年期氧化應激致鐵死亡的相關性研究

蘇 欣，梁 健，邱智楓，程 江，張麗翠△

(1.石河子大學醫學院，新疆石河子 832000；2.陜西省人民醫院心血管內二科，陜西西安 710000；3.中山市小欖人民醫院檢驗科，廣東中山 528400；4.石河子大學醫學院第一附屬醫院檢驗科，新疆石河子 832000)

鐵作為生命活動所必需的微量元素，在細胞運輸、生物合成、機體代謝過程中起重要作用，鐵缺乏、鐵負荷均會引起機體損傷，所以機體內鐵代謝的穩態調控至關重要[1]。氧化應激是指由于各種有害因素對機體的刺激，使機體處于過氧化狀態所出現的分子損傷，此時氧化與抗氧化系統不平衡，抗氧化系統不能完全清除沉積在體內的氧化產物導致組織損傷，從而使機體表現出來的疾病狀態[2]。然而，當鐵過量存在時，游離鐵可作為氧化應激反應的催化劑加速活性氧自由基(ROS)的生成，由于其極強的氧化性可損害一些大分子物質如蛋白質、核酸、脂質等，阻礙細胞的生長發育或誘發細胞死亡，這種細胞死亡的方式被稱作是一種新型細胞死亡方式， 即鐵死亡[3-4]。鐵死亡與神經系統疾病、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌等多種疾病相關，關于氧化應激與鐵死亡的關系一直是近幾年的研究熱點，而生命早期鐵缺乏對成年期氧化應激及鐵死亡的影響鮮有報道。本研究旨在通過建立生命早期鐵缺乏動物模型探討其對成年期大鼠氧化應激水平及鐵死亡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選擇健康雌性Wistar大鼠12只，體質量為180～220 g，健康雄性Wistar大鼠6只，體質量220～270 g，均購自新疆實驗動物中心。

1.2動物分組 給予大鼠普通飼料喂養，室內溫度控制在(20±2)℃，濕度50%～60%，保證每日光照時間約12 h，適應性飼養1周后，將雌性大鼠分為實驗組和對照組，每組各6只，分別給予低鐵、普通飼料喂養，飼料按美國官方分析化學師協會(AOAC)配方結合課題組前期研究結果經過改良后配制，實驗組低鐵飼料平均含鐵量為7.4 mg/kg，對照組普通飼料平均含鐵量為274.0 mg/kg，2組均自由進食，飲用去離子水。飼料干預2周后與健康Wistar雄鼠以2∶1比例同籠交配2周(即孕1周)，單獨分籠飼養，繼續飼料干預至子鼠出生后4周轉入鐵平衡期，給予普通飼料喂養至子鼠出生后16周處死，期間動態監測血常規、鐵蛋白等代謝指標，子鼠眼眶后靜脈叢采血后處死立即分離血漿放置于-80 ℃冰箱冷凍保存待用。

1.3實驗儀器及試劑 全自動模塊式血液體液分析儀購自日本希森美康醫用電子(上海)有限公司，型號：XN-20[A1]；鐵蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)檢測試劑盒均購自南京建成生物有限公司。

1.4檢測指標及測定方法 血紅蛋白(Hb)采用全自動血液分析儀檢測，鐵蛋白采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測吸光度，通過標準品制作標準曲線，應用ELISA Calc計算軟件求得鐵蛋白水平。SOD、MDA、GSH-PX、GST采用分光光度計法檢測吸光度，均嚴格按照說明書進行操作。

2 結 果

2.1子鼠鐵干預末期一般情況 子鼠出生后4周，對照組子鼠毛發正常，行為活動無異常，見圖1A。實驗組與對照組相比，活動較少，糞便顏色較淺，毛發稀疏，以背部最為明顯，見圖1B。且實驗組有啃食同類的異常行為，見圖1C。體型也明顯小于對照組，見圖1D。

2.2子鼠鐵干預期末各項指標

2.2.1鐵干預期末各組子鼠血液學指標 實驗組子鼠給予低鐵干預至4周齡，其紅細胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)、紅細胞壓積(HCT)、紅細胞平均體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)、紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)均低于對照組(P<0.01)，紅細胞分布寬度(RDW)高于對照組(P<0.01)。表現為小細胞低色素性貧血，見表1。

注：A表示對照組小鼠；B表示實驗組小鼠；C表示實驗組小鼠；D表示實驗組與對照組小鼠

圖1實驗組和對照組子鼠4周齡一般情況

表1 各組子鼠鐵干預期末血液學指標結果

2.2.2鐵干預期末各組子鼠體質量及鐵蛋白指標 鐵干預期末，實驗組子鼠體質量、鐵蛋白水平均低于對照組(P<0.01)，見表2。實驗組經過低鐵干預后出現了生長受限及鐵儲存量減少。

表2 各組子鼠鐵干預期末體質量、鐵蛋白結果

2.3子鼠鐵平衡末期(成年期)各項指標

2.3.1鐵平衡末期各組子鼠血液學指標 經過10周的鐵平衡期，成年期實驗組子鼠RBC、Hb、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW與對照組子鼠相比，差異無統計學意義(P>0.05)，實驗組子鼠的貧血狀況得到明顯的改善，見表3。

表3 各組子鼠鐵平衡末期血液學指標結果

2.3.2鐵平衡末期各組子鼠體質量及鐵蛋白指標 經過10周的鐵平衡期，成年期實驗組子鼠體質量與對照組相比,差異無統計學意義(P>0.05)，鐵蛋白水平明顯高于對照組(P<0.01)，見表4。子鼠鐵平衡期(14周齡)結束時，與鐵干預末期(4周齡)相比，體質量及鐵蛋白的增長率情況，實驗組增長率明顯高于對照組(P<0.01)，見表5。說明在鐵平衡期時，實驗組子鼠在遇到鐵營養相對富足的環境時出現了追趕生長，表現為體質量的快速增長和鐵吸收過多。

表4 各組子鼠鐵平衡末期體質量、鐵蛋白結果

表5 各組子鼠體質量、鐵蛋白增長情況(4～14周)對比分析

2.4成年期子鼠氧化應激水平 成年期實驗組子鼠氧化產物MDA高于對照組(P<0.01)，抗氧化酶活力SOD、GST、GSH-PX均低于對照組(P<0.01)，見表6。實驗組子鼠經歷過早期鐵缺乏環境，成年期機體出現氧化應激損傷效應。

表6 各組子鼠氧化應激水平結果

3 討 論

鐵作為各種生物過程中所必需的元素，存在于所有細胞內，是一種過渡性金屬元素。鐵缺乏和鐵負荷都會引起相關疾病，所以鐵穩態的調節和維持對人類生命健康至關重要。骨髓、肝臟、脾臟等器官都參與機體的造血活動，鐵主要以鐵蛋白和含鐵血黃素的形式存儲于其中，參與機體Hb和氧的運輸及生物體內一些生物化學過程，包括ATP的生成、DNA的合成等[5-6]。鐵具有潛在毒性，當與鐵結合的復合物超過機體正常生命所需達到飽和時，鐵負荷對機體的有害影響開始出現，游離鐵可參與氧化應激反應生成ROS，機體氧化抗氧化系統失衡，細胞內大量自由基堆積，細胞出現損傷和死亡，導致鐵死亡的發生，嚴重影響生命健康[7-9]。由于鐵死亡發生機制的復雜性，目前尚無有效的阻斷方法，本實驗通過建立早期缺鐵模型，探討生命早期鐵缺乏對成年期氧化應激的影響及對鐵死亡的促進作用，為減少鐵死亡的發生提供新思路。

鐵缺乏是全世界最主要的營養缺乏性疾病，多項研究表明，缺鐵性貧血患病率最高的人群首先是孕期婦女，其對母親和后代的影響也是不可低估的[10]。近年來大量調查研究發現，在生命早期如果處于營養不良的狀態，出生后及成年后的生長發育都會受到影響，歸因于在生命早期由于各種原因導致的身體所需的多元化營養素缺乏，機體為了適應環境生長所表現出來的一系列反饋信號，這些信號可導致控制正常生長發育的基因表達異常，對未來健康產生長遠影響[8]。

本實驗中實驗組子鼠在生命早期經歷過低鐵干預后，血液學指標RBC、Hb、HCT、MCV、MCH、MCHC均低于對照組，RDW高于對照組，表現為小細胞低色素性貧血，且實驗組鐵蛋白水平明顯低于對照組，由于生命早期實驗組子鼠鐵攝入量不足，Hb合成不足，長期鐵缺乏環境最終發展為缺鐵性貧血，同時實驗組子鼠鐵干預末期啃食同類的異常行為符合缺鐵性貧血的特點。鐵蛋白代表體內貯存鐵水平，用來評估機體鐵缺乏或者鐵負荷的狀態[11]，生命早期實驗組長期處于鐵缺乏狀態，機體鐵儲存量嚴重不足，出現鐵蛋白水平降低。同時生命早期實驗組子鼠在干預期末體型明顯小于對照組，體質量也低于對照組，由于營養物質缺乏，機體生長受限，這與SFERRUZZI-PERRI 等[12]的研究結論一致。經過10周的鐵平衡期各組子鼠進入成年期生長階段，成年期各項血液學指標、體質量無差異，實驗組子鼠鐵蛋白水平及鐵蛋白增長率均高于對照組。由于實驗組子鼠生命早期處于鐵缺乏環境，鐵營養不良狀態刺激了大量營養代謝過程中相關基因的表達，機體長期形成的生理機制在成長過程中根據環境條件適應性地提高吸收利用能力，滿足機體代謝而出現的吸收過多的現象，導致鐵負荷狀態。

生命早期鐵缺乏實驗組子鼠在成年期表現出鐵吸收過多，出現鐵負荷，游離的Fe2+可作為體內氧化應激反應過程中的催化劑，在機體鐵負荷時，Fe2+通過Fenton反應與Haber-Weis反應產生ROS，即Fe2++H2O2→Fe3++ OH-+HO-，加速機體氧化應激的過程，導致線粒體、溶酶體、DNA等損傷[13]。由于鐵儲存量的增加，導致超氧自由基生成增多，Fe3++O2-→Fe2++O2，而MDA是氧化應激過程中的代謝產物，通過檢測MDA可判斷機體氧化損傷的程度[14]。本實驗中成年期子鼠實驗組MDA水平高于對照組，說明生命早期受到低鐵干預的子鼠在成年期出現了氧化應激損傷，同時MDA一定程度上可間接體現機體抗氧化系統對氧自由基的清除能力，實驗組MDA水平升高說明機體抗氧化能力較低。SOD是機體抗氧化系統中固有存在的具有清除超氧自由基能力的物質，GSH-PX在H2O2與GSH反應中起促進作用，而此兩者生成的氧化型谷胱甘肽(GSSG)和水分子，在抗氧化過程中扮演催化劑的角色，催化H2O2分解，生成無毒的代謝產物，降低過氧化程度，對細胞膜結構和功能起保護作用[15-16]。GST在還原型谷胱甘肽的解毒機制中起催化作用，加速毒素清除過程從而達到解毒的目的[17]。而實驗組子鼠抗氧化系統SOD、GSH-PX、GST活力均低于對照組，抗氧化系統不足以清除體內大量堆積的ROS，致機體出現蛋白質、核酸、脂質等損害，從而刺激GSH修復作用增強，GSH受氧化應激的影響合成減少，依賴于GSH修復作用的GSH-PX在大量自由基的環境中不能阻止鐵依賴的脂質過氧化物轉變為高活性的脂質自由基。實驗組子鼠GST活力明顯降低，抗氧化作用弱，不能還原受損的DNA、蛋白質等物質，以上抗氧化系統功能的降低，致使細胞內大量自由基堆積，導致細胞損傷和死亡，最終引發鐵死亡。

4 結 論

鐵代謝的調節不僅對維持正常的細胞功能至關重要，而且對預防鐵介導的氧化應激所致鐵死亡的發生也至關重要。所以，在生命早期應當監測孕婦及胎兒鐵代謝指標，早期預防鐵缺乏，減少成年期鐵負荷致鐵死亡的發生。根據目前報道的鐵死亡相關研究，結合本實驗研究提出以下幾點：(1)單純鐵過載所致氧化應激最終導致細胞鐵死亡與生命早期低鐵干預致成年期鐵負荷現象引發氧自由基增多導致細胞鐵死亡調控機制是否相同，尚且需要進一步研究。(2)本實驗在成年期通過檢測酶學指標判斷氧化應激誘導鐵死亡的發生，可為以后的研究中進行細胞因子及基因分子水平檢測提供更精確的鐵死亡證據。(3)鐵死亡可介導腫瘤細胞死亡，通過誘導機體發生鐵死亡來消滅腫瘤細胞，如何來平衡氧化應激損傷與腫瘤的關系及如何誘導消滅特異性腫瘤細胞的鐵死亡，仍待研究。