現(xiàn)代月季組培技術(shù)育種研究進(jìn)展

黃曉玲

(浙江農(nóng)林大學(xué) 暨陽學(xué)院，浙江 諸暨 311800)

1 引言

現(xiàn)代月季(RosaChinensis)是薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(RosaL.)植物，被稱為花中皇后，是世界著名的四大切花之一。現(xiàn)代月季花色艷麗、香氣宜人，被廣泛應(yīng)用于園林、庭院裝飾，可作切花、花籃等，也是各類食品、化妝品的重要香料原料。目前世界各地栽培的月季，大多以中國月季為親本，經(jīng)長期不斷地選育和反復(fù)雜交而成，但因月季基因組的復(fù)雜性和遠(yuǎn)緣雜交的不親和性，加大了雜交育種的難度，而使組織培養(yǎng)成為月季較為有效的育種手段。

2 國內(nèi)外現(xiàn)代月季育種的研究進(jìn)展

由于月季花色豐富、應(yīng)用廣泛、育種關(guān)注度極高，所以致力于月季育種的工作人員也不在少數(shù)。法國以Gudin教授通過探究各種條件下花粉的育性、花粉和柱頭的不親和性等，開展了月季胚培養(yǎng)的研究工作。中國學(xué)者開始在月季資源收集、保護(hù)、育種等方面取得了階段性的成績，為干旱寒冷地區(qū)選育出多數(shù)露地栽培新品種。中國農(nóng)科院培利用抗寒、抗旱性強(qiáng)的野生薔薇類與現(xiàn)代月季雜交，培育出了耐低溫、長勢良好的優(yōu)良品種。張啟翔教授等從事月季抗黑斑病轉(zhuǎn)基因育種研究并取得良好成果。迄今為止，薔薇屬中大量的種質(zhì)資源還未開發(fā)利用，如果這些種質(zhì)資源參與目前現(xiàn)代月季的育種，必將在育種界產(chǎn)生新突破。

3 現(xiàn)代月季組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

目前現(xiàn)代月季的繁殖技術(shù)仍沿襲了傳統(tǒng)的扦插、嫁接、壓條等方法，這些方法限制了月季的繁殖量，不能滿足工廠化生產(chǎn)的需求。1980年Hasegawa 成功在MS培養(yǎng)基上建立了月季試管苗無性系，開辟了月季組培的先河，提高了月季的繁殖速度，且植株根系發(fā)達(dá)、生長健壯、苗木整齊，并且節(jié)省時(shí)間和土地面積，不受季節(jié)的限制，是批量繁殖生產(chǎn)月季商品苗的理想途徑之一。

為了進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化、突變育種、快速繁殖和品種保存，必須建立植株的再生系統(tǒng)。植株的再生一般經(jīng)歷從愈傷誘導(dǎo)、愈傷分化、胚狀體成熟萌發(fā)或芽的發(fā)育、到植株再生、完整植株的移植等步驟。下面將從叢生芽誘導(dǎo)、愈傷誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚狀體和器官發(fā)生等方面闡述月季的組織培養(yǎng)研究進(jìn)展。

3.1 叢生芽的誘導(dǎo)

1970年，Elliott首次在野薔薇(Rosamultiflora) 上成功地進(jìn)行了芽的繁殖和誘導(dǎo)幼苗生根。1976年，Zieslin等報(bào)道細(xì)胞分裂素有利于提高叢生芽的數(shù)量，但也增加了誘發(fā)花器官敗育或退化的頻率。不同種類的細(xì)胞分裂素對(duì)月季莖增殖的影響也不同，Marcelis等在添加相同濃度的細(xì)胞分裂素，研究結(jié)果表明，KT實(shí)際上對(duì)莖增殖沒有多少影響；而BA、ZT 、ZR都可顯著促進(jìn)莖的重量和長度增加。

3.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

1967 年Hill的實(shí)驗(yàn)證明在培養(yǎng)基中添加2, 4-D或添加NAA均能很快誘導(dǎo)出愈傷組織。該實(shí)驗(yàn)證明在培養(yǎng)基中添加 2, 4-D 或添加NAA均能很快誘導(dǎo)出愈傷組織。Lloyd等的實(shí)驗(yàn)表明月季愈傷組織的誘導(dǎo)與其品種的基因型有關(guān)。

3.3 體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生

體細(xì)胞胚狀體發(fā)生體系的建立將有助于現(xiàn)代月季的試管苗快繁、冷藏保存、人工種子的生產(chǎn)和基因的轉(zhuǎn)化操作等等。多年的研究證明體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生是現(xiàn)代月季微繁殖潛在的非常有效的方法。體細(xì)胞胚再生的基本培養(yǎng)基有MS、1/2MS、B5、SH 等。Kintzios 的實(shí)驗(yàn)證明在供試材料上使用NAA、BA 和GA3對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞胚狀體無效，CPA才是誘導(dǎo)體細(xì)胞胚狀體的決定因素。以上結(jié)果表明月季的體細(xì)胞胚狀體發(fā)生能力也因品種以及外植體的類型隨激素類型和濃度不同而有所變化。

3.4 器官發(fā)生

現(xiàn)代月季的芽器官發(fā)生表現(xiàn)為兩種類型：一類直接起源于外植體，不需經(jīng)過愈傷組織階段；而另一類需要經(jīng)歷愈傷階段的過程。以現(xiàn)代月季離體葉、根和愈傷組織為外植體誘導(dǎo)不定芽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加適當(dāng)濃度的BAP 和NAA的培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)不定芽發(fā)生，但隨著繼代次數(shù)的增加，不定芽發(fā)生能力降低，且繼代12周后，終止產(chǎn)生不定芽。

4 影響現(xiàn)代月季組培的主要因素

隨著現(xiàn)代月季組培技術(shù)的發(fā)展，不斷有研究者探討影響現(xiàn)代月季離體快速繁殖的因素，發(fā)現(xiàn)這些影響因素不是單一的，其中主要影響因素有外植體的選擇與滅菌、組培各階段中的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件選擇等，本文對(duì)這幾方面影響因素做了概述，為現(xiàn)代月季的工廠化生產(chǎn)提供依據(jù)。

4.1 外植體的選擇與滅菌

很多研究都證明枝條中部的腋芽萌發(fā)較頂部和基部時(shí)間早，且中部的腋芽長勢好，這可能與月季枝條不同部位的腋芽成熟程度及休眠狀態(tài)不同等因素有關(guān)。中部的腋芽增殖系數(shù)高，其次是基部，再次是頂部。但Podwyszynska等的研究表明外植體以第2節(jié)位的腋芽最有利于增殖，沈國正等分別以莖段和頂芽為外植體，發(fā)現(xiàn)莖段增效果好于殖頂芽增殖。李青等采用當(dāng)年生枝條的冬芽和腋芽為外植體進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)越冬芽成活率高，且萌動(dòng)所需時(shí)間較短，主要原因是芽內(nèi)積累了大量的營養(yǎng)物質(zhì)，能很快萌發(fā)生長。于冰沁發(fā)現(xiàn)垂直接種、斜向上45°接種是最佳的接種方式，水平接種其次，反轉(zhuǎn)接種的腋芽再生芽生長量明顯低于前3種接種方式，這可能與枝條原有的生長極性有關(guān)。

現(xiàn)代月季外植體滅菌通常采用酒精、升汞、次氯酸鈉溶液和新潔爾滅菌，滅菌時(shí)間的長短是影響滅菌效果的關(guān)鍵。消毒液濃度過大或處理時(shí)間過長的滅菌效果好，但易引起植物表面組織破壞，失去萌芽力。選擇外植體的時(shí)間對(duì)滅菌的效果也有影響，大體表現(xiàn)為春秋兩季較好。除特殊需要外，應(yīng)盡量避免夏季和冬季啟動(dòng)組培繁殖。

4.2 培養(yǎng)基和激素的選擇

現(xiàn)代月季組培的培養(yǎng)基大體分為啟動(dòng)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基。影響現(xiàn)代月季組培的植物生長調(diào)節(jié)劑主要有細(xì)胞分裂素、生長素和赤霉素(GA3)3 種。細(xì)胞分裂素參與克服頂端優(yōu)勢的過程，因而能促進(jìn)側(cè)枝的萌發(fā)和生長，嫩芽的繁殖主要是細(xì)胞分裂素影響的結(jié)果。生長素最明顯的作用是促進(jìn)生長，但其促進(jìn)作用因濃度而異，較低濃度促進(jìn)生長，較高濃度抑制生長。

4.2.1 啟動(dòng)培養(yǎng)

培養(yǎng)基的成分直接影響外植體的萌動(dòng)和分化。啟動(dòng)培養(yǎng)基一般以MS為基本培養(yǎng)基，細(xì)胞分裂素和生長素結(jié)合使用，較常使用的有6-BA、NAA、GA3。其中，6-BA的有效濃度為0.5～3.0 mg/L；NAA 的有效濃度為0.01～0.5 mg/L。實(shí)際上，使用不含激素的培養(yǎng)基，只要外植體沒有污染，枝條的養(yǎng)分充足，新芽即可長出。

4.2.2 繼代培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)受糖濃度、pH值、激素配比的影響。糖量加大、pH值降低會(huì)使月季繼代苗分化率提高20%，同時(shí)可縮短繼代周期，但糖濃度不可超過50 g/L，pH值不可低于5.5。適宜的激素種類和濃度配比是現(xiàn)代月季腋芽萌發(fā)和叢生芽增殖的關(guān)鍵。繼代培養(yǎng)中常使用的激素有6-BA、NAA、IBA、GA3。6-BA的有效濃度為0.1～3.0 mg/L，NAA的有效濃度為0.005～2.0 mg/L，IBA的有效濃度為0.01～0.3 mg/L。低濃度的6-BA有利于不定芽的增殖，濃度過高則抑制不定芽增殖；合適濃度的NAA 有利于芽和葉生長，但濃度過高誘導(dǎo)產(chǎn)生大量愈傷組織，不利于側(cè)芽的直接分化和生長。乙烯提高月季芽的增殖效果與濃度有關(guān)，以5 mg/L最佳，但乙烯不利于苗的長高。此外，培養(yǎng)瓶里的含水量、相對(duì)含水量、水汽壓都會(huì)影響月季芽的增殖。

4.2.3 生根培養(yǎng)

多數(shù)試驗(yàn)采用的生根培養(yǎng)基為1/2MS。研究發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基中鹽濃度過高，特別是氮素含量過高會(huì)導(dǎo)致生根不適應(yīng)，因此需減少無機(jī)鹽用量。生根使用的激素主要為IBA、NAA、IAA 等生長素，其中IBA有效濃度為0.01～1.0 mg/L、NAA有效濃度為0.01～1.0 mg/L、IAA 使用較少；李正平在月季組織培養(yǎng)中使用ABT生根粉，促進(jìn)生根濃度為0.5～10.0 mg/L，最佳濃度為0.5～2.0 mg/L。此外，在培養(yǎng)基中加入活性炭可以顯著促進(jìn)生根量和根的長勢，添加濃度為0.2～0.3%，這可能與活性炭對(duì)有害酚類物質(zhì)的吸附有關(guān)。

5 展望

盡管國內(nèi)外在現(xiàn)代月季組培方面取得了一定進(jìn)展，但現(xiàn)代月季的再生受基因型的影響很大，不同的品種在愈傷誘導(dǎo)、胚狀體及芽器官等的發(fā)生方面差異很大，且只有少數(shù)的品種能獲得相對(duì)高頻率的再生植株。因此，仍需加強(qiáng)現(xiàn)代月季植株再生研究，通過探索組織的培養(yǎng)途徑來加快現(xiàn)代月季的育種進(jìn)度和提高種苗的繁殖速度，早日實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代月季種苗工廠化生產(chǎn)以滿足市場的需求。