液質聯用測定土壤中的獸藥殘含量的方法改進

陳永銳，伍愛梅

液質聯用測定土壤中的獸藥殘含量的方法改進

陳永銳，伍愛梅

（廣東中藍檢測技術有限公司，廣東 佛山 528000）

土壤中的獸藥殘留含量是衡量土壤污染程度的一個重要標準。目前測定土壤中獸藥殘留含量的常用方法是液質聯用法，但傳統的液質聯用法存在操作困難、檢出量較大的缺點。實驗通過固相萃取和梯度洗脫的方法對傳統的液質聯用法進行了改進，改進后檢出范圍均為0.1～500 μg/L，同時還具備靈敏度高、操作簡易、重現性好的特點，可以滿足對土壤中獸藥殘留含量的檢測要求。

獸藥；四環素類抗生素；液質聯用；固相萃取

獸藥殘留通常指給動物使用藥物后蓄積和貯存在細胞、組織和器官內的藥物原形、代謝產物和藥物雜質。在現代社會，由于畜牧業的飛速發展，現代化、集約化和規模化的生產方式已經成為了當今中國畜牧業發展的主流。常見的獸藥殘留有抗微生物藥物（抗生素和化學合成抗菌素的統稱）、抗寄生蟲藥、生長促進劑和殺蟲劑等。抗微生物藥物是最主要的獸藥，添加劑和獸藥殘留占藥物添加劑總量的60%左右，而這其中四環素類抗生素（土霉素、四環素和金霉素）由于價格低廉且具有較強的殺菌抗炎效果而被廣泛應用于畜牧養殖行業。而未被吸收分解的四環素類抗生素會以糞便或尿液的形式排出體外，四環素類抗生素在自然環境中分解緩慢因而會導致土壤污染。為了檢測飼養場糞便處理廠附近的土壤中的情況，就需要對其土壤進行檢測。四環素類抗生素等獸藥殘留屬于微量至超微量的分析范疇，這對于儀器及分析方法都有較高要求。目前，常用的測量土壤中四環素類抗生素的方法是液質聯用法，本文對傳統的液質聯用法進行了改進。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

實驗儀器主要有：Agilent LC/MSD Trap XCT型電噴霧離子阱質譜搭配Agilent1100超高效液相色譜儀、JIUPIN-COS-2403CL恒溫震動搖床、JIDI-20R臺式多用途高速冷凍離心機、超聲波清洗機。

1.2 試劑與材料

本次實驗試劑、材料規格及產地如表1所示。

1.3 實驗準備

1.3.1 EDTA緩沖溶液的配置

首先將1 L質量濃度為0.1 mol/L檸檬酸溶液與0.625 L質量濃度為0.1 mol/L磷酸氫二鈉溶液相混合，然后加入0.5 L質量濃度為0.1 mol/L的EDTA溶液，調節pH至4.0左右。

表1 試劑與材料規格及產地表

名稱規格產地 乙腈色譜純中國醫藥集團有限公司 甲酸色譜純中國醫藥集團有限公司 乙二胺四乙酸二鈉優級純中國醫藥集團有限公司 三氯乙酸優級純中國醫藥集團有限公司 檸檬酸優級純中國醫藥集團有限公司 磷酸氫二鈉優級純中國醫藥集團有限公司 土霉素純物質安譜 四環素純物質安譜 金霉素純物質安譜

1.3.2 土壤的采集

本實驗檢測的土壤為浙江省湖州市安吉縣某年出欄量為500頭左右的小型養豬場的糞便處理池附近的種植耕地，這些種植耕地每年都會施加兩三次該廠區糞便（已連續5年以上）。本次在此種植地隨機取樣，取樣點分別采取地表層土壤（0～20 cm處）樣品和亞表層土壤樣品（20～40 cm處），同時采集該地區遠離糞便處理區且從未施加過糞便的土壤作為空白樣。

1.3.3 土壤的處理

由于土霉素、四環素和金霉素均屬于高極性的弱酸弱堿化合物，易與蛋白質結合，因此本實驗分別采用三氯乙酸和EDTA來提取土壤中的這些物質。

分別稱取土壤樣品5 g置于錐形瓶中，加入20 mL的EDTA緩沖溶液，充分震蕩后取上層提取液，重復3次后，將3次提取的上層提取液加入體積分數為10%的三氯乙酸0.5 mL，混均靜置后，置于離心機，8 000 r/min的條件下離心5 min。取上清液利用固相萃取柱（HLB小柱）對其進行富集，乙腈洗脫，氮吹至近干，用初始流動相（10%乙腈、0.1%甲酸溶液）定容1 mL，過膜待測。

1.3.4 標準溶液的配置

用初始流動相（10%乙腈、0.1%甲酸溶液）配制四環素、土霉素和金霉素的混合標準母液，再稀釋得到標準曲線濃度分別為0.1 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、250 μg/L、500 μg/L的標準溶液。

1.4 液相色譜-質譜檢測的條件

使用 LC-MS/MS 法測定土壤中四環素類抗生素殘留量。超高效液相色譜的色譜柱為ACQUTTY HPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫為35 ℃，進樣量為5 μL，流速為0.2 mL/min，其流動相為乙腈和0.1%甲酸溶液，進行梯度洗脫，程序如表2所示。

表2 梯度洗脫程序

時間/min流速/（mL/min）流動相A/（%）流動相B/（%） 00.21090 1.50.21090 30.25050 40.29010 5.50.29010 90.25050 120.21090

液相色譜所串聯質譜儀使用電噴霧離子源（ESI），離子源溫度為120 ℃，脫溶劑溫度為350 ℃，脫溶劑氣和錐孔氣為氮氣，脫溶劑氣流速為600 L/h，錐孔氣流速為50 L/h，碰撞氣為高純氬氣，采用多反應監測模式（MRM）檢測，測定使用ESI正離子模式，進樣量5 μL。

2 結果與討論

在上述實驗條件下對配置的標準溶液進行測定，繪制標準溶液曲線。本實驗的土霉素、四環素和金霉素的檢出范圍均為0.1～500 μg/L，在該范圍標準曲線均呈現出較強的線性相關，色譜的峰型較為尖銳，其線性相關系數的值均大于0.998 9，儀器重現性RSD均小于1%。以此為樣品對土壤樣品進行檢測，其結果如表3所示。

實驗結果表明：糞便處理池附近的種植耕地的土壤樣品中的四環素類抗生素含量較高，土壤亞表層的四環素類抗生素為土壤表層1/3～1/2的水平。

遠離糞便處理區且從未施加過糞便的土壤仍檢測出四環素類抗生素，這說明四環素類抗生素可能具有很強的環境遷移性，需要引起相關部門的注意。

表3 土壤樣品中的土霉素、四環素和金霉素含量情況

樣品名土霉素含量/（μg/kg）四環素含量/（μg/kg）金霉素含量/（μg/kg） 樣品A 表層342425167 樣品A亞表層15613299.9 樣品B表層43.611.215.4 樣品B亞表層15.98.453.56

注：糞便處理池附近的種植耕地的土壤樣品為樣品A，遠離糞便處理區且從未施加過糞便的土壤為樣品B。

3 實驗結論與展望

為了簡便、準確地檢測出土壤中的獸藥殘留含量，為土壤實時檢測提供依據，本實驗以土壤中獸藥殘留含量最高的四環素類抗生素為例，通過固相萃取、梯度洗脫的方法對液質聯用測量土壤中四環素類抗生素含量的方法進行了改進。此改進方法既可以提高對土壤中的獸藥殘留的提取效率，又可以準確定性土壤中獸藥殘留物質，檢出范圍均為0.1～500 μg/L，且具有較好的重現性，還具備靈敏度高、操作簡易的特點，可以滿足土壤獸藥殘留含量檢測的要求。

本實驗改進了一種通過液質聯用測定土壤中獸殘含量的方法，這將大大提高獸藥殘留物組分的測量精度和速度。但僅有測量方法還不夠，解決獸藥殘留的根本還在于制訂相應的法律法規，嚴格規范獸藥的安全生產和使用，同時，還要加大宣傳，學習和借鑒國外先進的飼養管理技術，合理使用獸藥。

［1］勾新磊，劉偉麗，高峽，等.液相色譜-串聯質譜技術在食品藥品安全分析領域的應用［J］.食品安全質量檢測學報，2016（11）：4283-4288.

［2］張志強，李春花，黃紹文，等.土壤及畜禽糞肥中四環素類抗生素固相萃取——高效液相色譜法的優化與初步應用［J］.植物營養與肥料學報，2013，19（3）：713-726.

TS207.3

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2019.15.049

2095－6835（2019）15－0120－02

〔編輯：張思楠〕