質譜技術在蛋白質糖基化研究中的應用

胡燕嫻，孫晉紅，潘瑩，季芳，康濤，郭嘉杰，邵秀穩

質譜技術在蛋白質糖基化研究中的應用

胡燕嫻，孫晉紅，潘瑩，季芳，康濤，郭嘉杰，邵秀穩

（廣東省藥品監督管理局審評認證中心，廣東 深圳 518000）

隨著蛋白質組學研究的不斷發展，蛋白質糖基化也越來越受到人們的廣泛關注。糖基化修飾是蛋白質翻譯后最主要的修飾方式之一，在生物過程中發揮著至關重要的作用。質譜由于操作簡便并具有極高的靈敏度和準確度，已成為蛋白質組學中最主要的技術之一，不同原理的質譜在蛋白質糖基化研究具有獨特的優勢，可進行定性定量分析，包括相對分子量的測定、糖基化位點的鑒定、糖鏈組成的解析及定量分析等方面。

蛋白質糖基化；質譜技術；糖鏈；定性定量分析

1 引言

蛋白質糖基化指單糖或寡糖與蛋白質之間通過共價結合形成糖蛋白的過程，50%以上的蛋白質存在糖基化現象[1]。根據蛋白質被糖類修飾形式的不同可以把蛋白質糖基化分為四類：O位糖基化、N位糖基化、C位糖基化及糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定連接。糖基化可改變分子結構的特異性，影響細胞間的識別、黏附、代謝及免疫等過程，從而影響疾病的發生發展過程。例如N-聚糖上的末端殘基、唾液酸參與免疫和細胞間通訊[2]。粘附蛋白的糖基化可以在很大程度上影響它們的結合特性，影響細胞-細胞或細胞-基質黏附功能[3]。因此檢測蛋白質翻譯后修飾的變化，可以確定新的靶點，為疾病的治療尋找新方法。

有關蛋白質糖基化修飾現象的研究，一方面研究其中的蛋白表征，即鑒定糖基化氨基酸位點；另一方面研究糖蛋白中的糖鏈表征，即確定糖鏈的組成及相對分子質量。質譜具有靈敏度高、可獲得多種結構信息和適于分析混合物等優點，是糖蛋白定性定量分析的一種理想手段。在質譜中，由于糖蛋白骨架中的糖骨架和蛋白骨架都會有一定的斷裂規律，所以根據質譜所得到的圖譜可以進行相對分子量的測定、糖基化位點的鑒定、糖鏈組成的解析及定量等分析工作。

2 質譜（Mass Spectrometry，MS）分析技術

質譜分析技術是在電場和磁場中分析具有不同質量的帶電分子、原子或離子碎片，可了解分子量、分子式或者分子結構等方面的信息。應用于蛋白質糖基化研究中的質譜主要有快原子轟擊質譜（FAB-MS）、電噴霧電離質譜（ESI-MS）、基質輔助激光解析譜儀（MALDI-MS）等。串聯質譜及多級質譜技術已經是研究和應用熱點，其對糖鏈的解析可獲得更完整的結構[4]。

2.1 快原子轟擊質譜（FAB-MS）

快原子轟擊質譜是最早被引入到糖鏈分析領域的質譜技術，它使用氬或氙等高能粒子照射液態基質中的待測物質分子，分子吸收能量被激發從而碎裂成離子。一般情況下，用快原子轟擊得到的主要是分子離子或準分子離子，而碎片離子很少。分析樣品無需經過氣化而直接電離，操作簡便，信號穩定。快原子轟擊質譜已被證明是分析糖蛋白結構的一種有力的方法，它不僅可以測定寡糖及其衍生物的相對分子質量（Mr），而且可以測聚合度高于30的糖鏈的Mr。衍生化可以提高質譜對糖鏈檢測的靈敏度。Okamoto在陰離子和陽離子FAB-MS2兩種模式下，分別對天然及2-氨基吡啶（PA）衍生化的唾液酸寡糖進行檢測和結構分析，研究表明，經2-PA衍生化唾液酸寡糖的檢測靈敏度明顯高于未衍生化的寡糖[5]。

2.2 電噴霧電離質譜（ESI-MS）

電噴霧電離質譜是一種通過電噴霧，將溶液中的離子轉變為氣相離子而進行質譜分析的方法。電噴霧在離化時能量更低，具有較高的離子化效率及靈敏度，分子質量范圍更寬，適合各種微量糖鏈或其衍生物樣品的分析。在電噴霧電離質譜中，高分子量的分子通常會帶有多個電荷，電荷狀態的分布可以精確對分子量定量，同時提供精確的分子質量和結構信息。電噴霧電離質譜能檢測非衍生化的糖，可區分非衍生化寡糖的連接方式（O-或N-），確定寡糖的結構、聚合度及組成。對于衍生化糖的測定，電噴霧電離質譜能精確糖蛋白的Mr及結構不均一性，同時確定糖蛋白中寡糖序列和連接方式。

2.3 基質輔助激光解析電離質譜（MALDI-MS）

基質輔助激光解析電離質譜的檢測原理是將待測物的溶液和某種基質溶液混合，蒸發溶劑，使待測物與基質成為晶體或者半晶體，再用一定波長的激光進行照射，基質吸收能量后傳遞給待測物，使被分析物氣化從而實現離子化。目前基質輔助激光解析電離質譜儀是一種簡單檢測癌癥和各種組織（包括血液，血清和肌肉）疾病中糖基化改變的常用工具[6]。它是第一個用于檢測全血清聚糖譜分析的方法，如用于N-糖鏈。基質輔助激光解析電離質譜除了用于檢測腫瘤標記物外，還有助于進一步闡明復雜生物樣品中蛋白質糖基化的特點。不同腫瘤組織具有不同的聚糖譜，基質輔助激光解析電離質譜可在福爾馬林固定石蠟包埋組織中定位成像N-聚糖[7]。若基質輔助激光解析譜儀能與飛行時間檢測器或其他高性能檢測器聯合，則能獲得更多精準信息。

2.4 串聯質譜

2.4.1 液相色譜-電噴霧質譜（LC-MS）

在糖組學和糖蛋白質組學分析中，液相色譜-電噴霧質譜是一種理想有效的研究方法，其可提高分析結果的準確性及提供豐富的糖鏈信息。液相色譜-電噴霧質譜可分析單糖組成及結構信息，進一步增加了寡糖分析的深度。這種方法是目前用于異構體分離和MS檢測的最穩定可靠的方法。親水相互作用液相色譜（HILIC）已用于分離和標記的聚糖。SONG等人研究顯示通過使用液相色譜-電噴霧質譜可檢測血清中聚合度超過170的聚糖結構[8]。

2.4.2 毛細管電泳質譜聯用（CE-MS）

毛細管電泳質譜聯用方法可以獲得樣本中多種信息，如遷移時間、分子質量及離子碎片信息等[9]。它具有高通量和高分辨率的特點，因而可將其提高樣本檢測的準確率和效率，基于以上優勢可將其用于糖組學和糖蛋白質組學分析中。SUN等將一種新型電動壓力的接口技術用于毛細管電泳質譜中，該方法用于鑒定肝素寡糖的結構[10]。

3 應用

3.1 相對分子質量的測定

電噴霧電離質譜或基質輔助激光解析電離質譜可對富集純化的各種糖鏈進行相對分子質量檢測，從而得到糖鏈混合物的相對分子質量指紋譜，以獲得樣品中糖鏈群體的總體分布特征。毛文君等采用電噴霧質譜準確判斷出6種瓊膠寡糖的分子量[11]。

3.2 糖鏈組成的解析

直接進行MSn分析，或者將糖鏈全甲基化之后進行氣相色譜-質譜（GC-MS）分析，可鑒定糖鏈內部單糖或寡糖的連接方式。GC-MS配置的電子轟擊或化學離子化等離子源可以使GC分離后的各種糖鏈衍生物分別得到充分裂解，依據糖鏈分子裂解規律對碎片離子產生的質譜信號進行分析，則可以確定糖苷鍵的類型。

ESI串聯質譜可以對MS和MS/MS譜圖進行解析，另外，離子肼和傅立葉變換離子回旋共振（FTICR）在分析糖鏈結構方面有獨特優勢。采用酶法將所有N-糖鏈從人血漿蛋白上切割下來，然后通過純化、富集和回收，得到糖鏈再經過常規的還原和甲基化，最終用于電噴霧電離質譜及MSn分析，從而確定了人血漿106種N-連接糖鏈的單糖組成[12]。

3.3 糖基化位點的鑒定

確定糖基化位點的途徑主要有兩種：①通過尋找糖基特征離子，進而確定糖肽，比如NacGlc特征離子為m/z 204；②通過比對酶處理前后酶解肽圖，在總離子流色譜圖（TIC）上，酶解前的糖肽峰酶解后消失，出現去糖肽，根據去糖肽的相對分子量及MS/MS圖確定糖基化位點。TSARBOPOULOS等分析了重組人白細胞介素-4的糖基化位點及部分糖鏈結構[13]。

3.4 定量分析

每個物質都有固定的質量，根據質譜圖中的峰強可以進行定量分析。基于質譜的糖鏈定量分析方法主要有絕對定量和相對定量兩種，絕對定量需要選待測糖鏈的標準品，但對于生物樣品中復雜的糖鏈，獲得標準品非常困難。目前主要采用內標法進行相對定量研究，即向樣品中加入一定量的內標物，通過測量與被分析物的相關響應值進行定量。薛向東等建立了一種基于電噴霧電離質譜的苯胺穩定同位素標記對還性寡糖鏈進行相對定量分析的研究方法，將其應用于人奶中游離寡糖和牛奶中游離寡糖的分析，結果表明，人奶中的乳糖含量高于牛奶[14]。

4 結束語

在生命活動中，蛋白質作為新陳代謝的承擔者，糖基化可改變蛋白質的結構及功能。在一些熱門研究領域，如發現腫瘤細胞表面糖基化的改變在腫瘤發生，甚至發展轉移中起著重要作用。臨床中常用的腫瘤標記物，如CA125、CA199等是腫瘤中異常糖基化的結果。糖蛋白的合成是在多種多樣的酶作用下形成，在同種分子的同一糖基化位點，糖鏈的結構也會存在差異。質譜作為發展新技術，被認為對糖基化分析具有明確的優勢，可對各種糖鏈進行結構分析。相信隨著質譜分析技術的不斷發展，其在糖蛋白糖基化研究中的應用將極大地拓展對糖蛋白的生物學功能認識。

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O657.63

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2019.15.063

2095－6835（2019）15－0151－03

〔編輯：嚴麗琴〕