以寨卡病毒NS3解旋酶為靶點的海洋天然產物庫的虛擬篩選與成藥性評價

曾志平

(廈門大學藥學院，福建省藥物新靶點研究重點實驗室，廈門大學高通量藥物篩選平臺，福建 廈門 361102)

寨卡病毒是一種蟲媒病毒，于1947年從非洲烏干達寨卡森林中的恒河猴體內分離；雖然其致死率較低，但是2015年在巴西爆發寨卡病毒疫情后，發現孕婦如果感染寨卡病毒，可能會導致新生兒發生小頭畸形而影響后期的發育(已超過4 000例)[1].除此之外，近期研究表明它還與成人的格利-巴利綜合征[2]、急性脊髓炎[3]、眼葡萄膜炎癥[4]及腦膜炎[5]等疾病密切相關.更為嚴重的是，2017年有研究報道寨卡病毒容易發生變異，使其更具有攻擊性及毒性，從而在未來可能對人類的公共衛生安全構成較大的隱患[6].此外，由于人類對寨卡病毒基礎研究的滯后，迄今為止仍沒有相關治療寨卡病毒病的藥物上市，因此，如何開發一類治療寨卡病毒病的藥物已成為緊迫的課題[7].

寨卡病毒是由11 kb的堿基組成的一類RNA病毒，編碼3 419個氨基酸，經過水解后可以得到以下一系列蛋白：衣殼蛋白(capsid)、包膜蛋白(envelope)、M蛋白、蛋白水解酶(NS1、NS2A、NS2B和NS3)、解旋酶(NS3)、甲基轉移酶(NS4、NS4B和NS5)及聚合酶(NS5)等[7].除M蛋白、NS2A、NS4和NS4B外，其他蛋白都有大量的晶體數據報道.隨著NS2B和NS3蛋白水解酶[8-9]、NS3 解旋酶[10]及NS5甲基轉移酶[11]等結構的解析，基于晶體結構的藥物虛擬篩選研究也相繼開展[12-16]，但目前還沒有得到令人興奮的結果.2017年有研究發現PrM蛋白上第139位絲氨酸變為天冬酰胺可能會導致病毒攻擊性增強[6]，值得慶幸的是，除此之外，寨卡病毒并未發生變異，這可能與目前仍沒有藥物治療寨卡病毒病相關.NS3解旋酶在寨卡病毒基因組的復制及病毒RNA的合成過程中發揮重要作用，因此成為治療寨卡病毒病的重要靶點.

NS3解旋酶主要由3個結構域組成.最近，Munawar等[17]利用碎片庫及核磁共振(NMR)等手段發現了2個可供藥物結合的新口袋(圖1和2)，引起廣泛的關注:口袋A(RNA結合位點)是一個表面結合口袋，它對于NS3解旋酶與NS5聚合酶2個病毒蛋白的相互作用起到非常重要的調控作用，如果有化合物占據此口袋，可能使二者的相互作用消失，從而影響病毒復制復合體的形成，抑制病毒的復制;口袋B(ATP結合位點)位于NS3解旋酶3個結構域的交叉點，是一個柔性但高度保守的變構調節口袋，使NS3解旋酶的結構具有動態性,而小分子在口袋B的結合會使NS3解旋酶穩定在一個特定的構象，從而可能破壞NS3解旋酶的正常功能.因此，口袋A和口袋B成為全新的調控NS3解旋酶生物學活性的重要口袋.

近年來，海洋天然產物由于其化學結構的多樣性，越來越受到藥物化學家們的青睞[18-20].本研究擬對寨卡病毒的NS3解旋酶蛋白的上述2個口袋開展海洋天然產物的藥物虛擬篩選分析，并對結合較好的海洋天然產物進行初步的成藥性分析，以期為尋找治療寨卡病毒病的化合物提供新思路.

(a)口袋A的表面結合部分及重要氨基酸；(b)口袋A的位置示意圖.圖1 NS3解旋酶的結構生物學模型與口袋A的位置Fig.1 Structure biological model of NS3 helicase and the position of site A

(a)口袋B的結合部位及重要氨基酸；(b)口袋B的位置示意圖.圖2 NS3解旋酶的結構生物學模型與口袋B的位置Fig.2 Structure biological model of NS3 helicase and the position of site B

1 研究方法

1.1 蛋白準備與結合口袋分析

雖然文獻[17]中已報道了NS3解旋酶的2個新穎的結合口袋，但是它們與碎片分子結合的核磁結構尚未上傳到蛋白質晶體數據庫(PDB)以供下載，因此本研究采用文獻[17]中口袋A(圖1)和口袋B(圖2)附近的關鍵氨基酸來定義分子對接所需的格點盒子(grid box)位置，并用本課題組自行構建的海洋天然產物庫的分子結構在此口袋進行打分評估.根據PDB ID：5Y4Z下載到NS3解旋酶的晶體結構[21]，并用薛定諤軟件中的蛋白準備模塊(protein preparation wizard)進行蛋白的預處理，如除去晶體水分子、加上氫原子，在pH 7.0下用PROPKA程序計算每個氨基酸側鏈的質子化狀態；然后用薛定諤軟件自帶的OPLS3e力場及impref腳本進行蛋白復合體的結構優化，除去不合理的碰撞接觸等.

1.2 配體準備

5 969個海洋天然產物的初步數據來源為海藻代謝物數據庫(Seaweed Metabolite Database，http:∥www.swmd.co.in/)、UNPD(Universal Natural Products Database，http:∥pkuxxj. pku. edu. cn/UNPD)天然產物數據庫中的海洋來源小分子及《中華海洋本草：海洋天然產物》[22].將前兩個數據庫的分子直接導入薛定諤軟件套裝并進行三維結構轉換；而對于《中華海洋本草：海洋天然產物》中的化合物，先用ChemDraw構建二維結構分子，再用Chem3D把二維結構分子轉換為三維結構分子，優化的力場參數為MM2.搜集到的分子最后用配體準備模塊(LigPrep)優化計算后重新進行化合物編碼，依次命名為MNPD000001～MNPD005969.

1.3 口袋A和口袋B結合位點的成藥性分析

用薛定諤軟件套裝的Sitemap 2.3模塊對口袋A和口袋B的結合位點進行成藥性分析.以siteA-1和siteB-3兩個NMR測定的小分子位點作為結合口袋區域,配置參數如下：Site Point個數設置為最少15個；對疏水相互作用采用更加嚴格的條件算法，同時用經典的格點文件進行計算.

1.4 分子對接分析

基于口袋A的分子對接分析：以口袋A覆蓋的10個重要氨基酸(ARG439、VAL440、ILE441、ASN568、ILE571、MET572、MET595、ALA597、CYS600和SER601)為關鍵氨基酸(圖1(a))，首先定義這些氨基酸的坐標中心為分子對接口袋的中心；同時，定義格點盒子形狀為立方體，邊長為2 nm，用受體格點文件程序(receptor grid generation)產生格點文件.為了提高虛擬篩選的效率，采用薛定諤軟件中的HTVS、SP及XP模塊進行逐級篩選.HTVS與SP的打分函數(Glidescore)相同，但HTVS算法通過降低尋找配體的構象數來加速對接的過程;而XP算法的打分函數比HTVS與SP的更精細(主要增加了配體與受體的去溶劑化懲罰項等，從而降低了虛擬篩選過程中的假陽性率)，并充分考慮了配體與受體口袋的性狀補償等，因此將耗費較長的計算時間.本研究中用HTVS算法對5 969個海洋天然產物的小分子庫進行初步篩選；對于得到的排名前200個化合物，進一步用SP算法進行中等精度的篩選;最后對于排名前50個化合物，利用高等精度的XP算法篩選并分析結果.所有篩選方法如無提及均采用默認參數.以文獻[17]中的碎片分子9H-嘌呤-2,6-二胺化合物作為參照物進行XP分子對接.

基于口袋B的分子對接分析：以口袋B覆蓋的14個重要氨基酸(VAL191、ALA287、HID288、ARG298、PHE314、THR316、GLU413、THR449、ALA451、SER452、GLN455、TRP487、TYR508和GLU511)為關鍵氨基酸(圖2(a))；格點盒子的產生及參數設置、分子對接的過程及方法與口袋A的完全一致.以文獻[17]中的碎片分子N-(4-氯乙基)肼甲酰胺作為參照物進行XP分子對接.

1.5 海洋天然產物的吸收、分布、代謝、排泄及毒性預測分析

在薛定諤軟件中的QikProp v5.7模塊下，采用正常模式對化合物進行了基于配體的ADMET預測(ligand-based ADME/Tox prediction).QikProp v5.7主要根據95%已經上市的藥物進行模型訓練，同時也對30個可能導致假陽性的反應官能團進行了注釋，基本滿足本研究對成藥性的評價要求.對篩選得到的海洋天然產物進行成藥性評估，計算的描述符及參數包括：經典的成藥五規則評價(# stars、# rotor、donorHB、acceptHB、SASA、PSA、QPlogP油水分配系數o/w、QPlogS及違反五規則數目rule of five)、藥物代謝能力評價#metab、藥物與血漿蛋白結合能力評價QPlogKhsa、藥物人體口服吸收能力評價human oral absorption、藥物透皮吸收能力評價QPPCaco以及藥物心臟毒性評價QPlogHERG等.

2 結果與分析

2.1 基于口袋A的虛擬篩選結果分析

口袋A位于NS3和NS5蛋白的交界處，是蛋白間相互作用的重要區域，該配體結合位點淺，根據Sitemap 2.3模塊的計算結果表明：其成藥性計算參數如Sitescore、Dscore及Size均不如口袋B，這可能與口袋A傾向于表面結合同時缺少一個穩固的疏水口袋相關.盡管如此，此位點卻在病毒復制復合體的形成過程中具有非常重要的作用，其中ASN569若突變為ALA，則病毒復制復合體無法形成，從而阻止病毒RNA的復制與傳染；而此位點在寨卡病毒、登革熱病毒等黃病毒屬病毒中高度保守.類似地，高度保守的堿性強極性氨基酸ARG439可以通過降低溶劑可極化表面極性來介導NS3解旋酶與其他蛋白的相互作用.此外，形成口袋A邊界的非極性氨基酸如ILE571、ILE441和ALA597也在黃病毒屬病毒中高度保守[17，23].上述關鍵氨基酸能與篩選所得的化合物產生重要的相互作用.首先把9H-嘌呤-2,6-二胺化合物進行XP對接(圖3(a))，對接的結合能為-19.640 kJ/mol，且發現它能很好地重復文獻[17]中的結果，即主要氨基酸的氫鍵長度均與NMR數據一致，證明了本研究中對接參數設置的準確性；但其分子較小，因此無法與關鍵氨基酸ARG439、ASN568發生明顯的相互作用.最終進入XP對接的化合物結合能范圍為-6.280～-41.307 kJ/mol，因此本研究取優于9H-嘌呤-2,6-二胺化合物(即結合能低于-19.640 kJ/mol)且與口袋的關鍵氨基酸有重要相互作用的分子進行分析；由于篇幅有限，本文中僅展示最具有結構代表性的5個化合物的對接分析結果(圖3(b)～(f)，附錄(http:∥jxmu.xmu.edu.cn/upload/html/20190605.html)表S1).

化合物分子中綠色表示碳原子，藍色表示氮原子，灰色表示口袋的氨基酸，紅色表示氧原子，黃色表示硫原子(下同).圖3 海洋天然產物與寨卡病毒NS3解旋酶口袋A的分子對接分析Fig.3 Molecular docking analyses of marine natural products towards the binding site A of NS3 helicase of Zika virus

1) divanchrobactin(MNPD001378)：該化合物為棕黃色油狀物，由Sandy等[24]于2010年報道，從海洋弧菌Vibriosp.DS40M4中分離得到，目前尚無生物學活性的相關報道.通過XP算法計算，divanchrobactin的結合能為-41.307 kJ/mol，遠低于碎片分子9H-嘌呤-2,6-二胺化合物的結合能，原因可能是該分子類似于四肽分子，分子質量和體積較大，官能團豐富，與口袋A表面結合位點的氨基酸存在較多的相互作用(圖3(b))，如：2個精氨酸側鏈和絲氨酸側鏈能與口袋A的CYS600、ASN568、ASN569、THR570、ILE571和MET572等主鏈酰胺鍵存在不同程度的相互作用，這與9H-嘌呤-2,6-二胺化合物的相互作用類似但更豐富;此外，其首尾的苯二酚結構能與SER365的側鏈羥基形成鍵長0.293 nm的強氫鍵，與ALA443的酰胺鍵形成鍵長0.271 nm的強氫鍵，同時苯環區域還能與口袋A中保守的關鍵疏水氨基酸ILE441等形成疏水相互作用.上述這些使divanchrobactin獲得了額外的結合能.

2) bromophenol(MNPD005219)：該化合物為白色針狀物，屬于含溴多酚類化合物，由Fan等[25]于2003年從紅藻(Rhodomelaconfervoides)中提取分離得到;它含有5個溴原子，是海洋天然產物的一個典型特征，有降糖及抗肥胖作用[26].該化合物與NS3解旋酶的結合能為-27.888 kJ/mol，其中主要的相互作用為5個酚羥基均與氨基酸主鏈形成較強的氫鍵，而5個溴原子對結合能的作用不明顯;與divanchrobactin不同的是，其中一個溴原子能與口袋A中關鍵氨基酸ARG439的胍基有較好的接觸，這可能類似于同主族的氟原子有類氫鍵的相互作用;與此同時，該化合物還與保守氨基酸ALA597和ILE571具有較強的疏水相互作用(圖3(c)).

3) 2-hydroxy-1′-methylzeatin(MNPD000865)：該化合物為細胞分裂素(cytokinin),來源于綠藻[27-28]，其結構較小，與碎片分子9H-嘌呤-2,6-二胺化合物具有相同的母核，因此結合方式也與之非常類似.由于cytokinin的五六元環上缺少氨基，所以它的羥基代替氨基可與CYS600、MET572的羰基形成較強的氫鍵(鍵長分別為0.386和0.279 nm),而五六元環上的2個氫鍵與9H-嘌呤-2,6-二胺化合物的幾乎一致;不同的是，cytokinin的烯丙位的羥基與LEU442的羰基形成額外的氫鍵(鍵長0.266 nm)，這也是cytokinin稍優于9H-嘌呤-2,6-二胺化合物的原因;此外，該化合物還與關鍵氨基酸ALA597和ILE571形成較強的疏水相互作用(圖3(d)).

4) garveatin E(MNPD002933)：該化合物于2006年從東北太平洋海洋水螅體Garveiaannulata中分離得到[29]，并被證明是吲哚胺2,3-雙加氧酶的抑制劑.該化合物是三環結構，且沒有氮原子的存在，這大大削弱了類似于9H-嘌呤-2,6-二胺化合物的氫鍵相互作用，因此其結合能不低(-21.817 kJ/mol)；其作用方式主要是利用母核上的羰基與羥基分別與ARG439的胍基、MET572和ASN569的酰胺鍵形成強氫鍵；與此同時，三環結構能與CYS600、ALA597、MET595、ILE571和ILE441發生疏水相互作用從而促進garveatin E與口袋A的結合(圖3(e)).

5) 2-hydroxy-6-methylaminopurine(MNPD000958)：該化合物早期從綠藻和藍珊瑚中分離得到，屬于細胞分裂素的一種[30]，與cytokinon及9H-嘌呤-2,6-二胺化合物的結構很類似.目前它已被開發為單磷酸腺苷依賴型蛋白激酶(AMPK)的激動劑[31]，用于治療代謝性疾病.其結合能為-19.720 kJ/mol,與9H-嘌呤-2,6-二胺化合物的相當，且結合方式分析表明兩者的氫鍵相互作用幾乎一致，但此化合物的2位羥基由于氫鍵的飽和性，只能與MET572形成單氫鍵，而難以與CYS600的酰胺基再形成氫鍵;還有一處不同的是，此化合物6位氨基的甲基化可能與保守且重要的ALA597存在疏水相互作用而會稍微改善結合能，這是由于它附近無氫鍵受體能與之相互作用，而雜芳香環可與保守的ILE571發生疏水相互作用從而增強其結合能力(圖3(f)).

綜上，共剖析了5個海洋天然產物在口袋A的相互作用:由于口袋A的可開放性，它能容納分子質量較大的小分子；該口袋主要通過氫鍵網絡來維持配體的相互作用，且這些相互作用在5個海洋天然產物中較保守，與文獻[17]的結果類似.因此，上述證據暗示這5個化合物可能是寨卡病毒NS3解旋酶的配體.

2.2 基于口袋B的虛擬篩選結果分析

與口袋A完全不同，口袋B的結合位點深埋在蛋白內部且空間狹長，位于NS3解旋酶3個結構域的交界處(圖2)，但與RNA結合位點又有所差別.該結合位點的氨基酸呈疏水區(THR316、VAL191、ALA287、PHE314、TYR508和TRP487)和親水區(HID288、GLU413、SER452、THR449和GLN455)兩極分布，且在人類所有的黃病毒屬病毒(如登革熱病毒、昆津病毒、谷腦炎病毒等)中高度保守，暗示口袋B可能是非常重要的影響NS3解旋酶結構與功能的結合口袋.這也與文獻[17]中N-(4-氯乙基)肼甲酰胺的分子結構形狀相互匹配.基于Sitemap 2.3模塊的口袋成藥性分析表明：對于優化后的NS3解旋酶，口袋B具有比口袋A更好的成藥性.Sitescore作為判斷藥物結合與否的重要依據，默認計算值大于0.8的即可作為藥物結合口袋,而口袋B的計算值為1.14，暗示該處是一個強的藥物結合口袋.而作為區分成藥性與非成藥性的Dscore參數，口袋B的計算值也達到0.96，滿足口袋成藥性的要求.對該化合物進行重新對接分析(圖4(a))，其結合能為-21.227 kJ/mol，稍優于9H-嘌呤-2,6-二胺化合物在口袋A的結合能.其結合方式主要依靠疏水的苯環區域及極性末端與極性氨基酸的相互作用；而進入XP算法對接的化合物結合能范圍為-6.816～-35.173 kJ/mol，因此本研究取優于N-(4-氯乙基)肼甲酰胺化合物(即結合能低于-21.227 kJ/mol)且與口袋的關鍵氨基酸有重要相互作用的結果進行分析；由于篇幅有限，本文中也僅展示最具有結構代表性的5個化合物的對接分析結果(圖4(b)～(f)與附錄表S2).

圖4 海洋天然產物與寨卡病毒NS3解旋酶口袋B的分子對接分析Fig.4 Molecular docking analyses of marine natural products towards the binding site B of NS3 helicase of Zika virus

1) aromatic polyketides(MNPD001827)：該化合物為黃色針狀物，屬于芳香聚酮類化合物，由Du等[32]于2008年從海洋真菌白曲霉(Aspergillusglaucus)中分離得到.該類化合物有一個芳香性的疏水雙環，同時以多羥基糖環作為極性基團結尾，這樣的結構與N-(4-氯乙基)肼甲酰胺化合物很類似，這也是它用Glide計算所得結合能最低(-35.173 kJ/mol)的原因.相互作用分析表明：芳香環能與口袋B的關鍵氨基酸如PRO320和HID288等存在疏水相互作用；與此同時，芳香環的羥基能與THR318主鏈的羰基形成鍵長0.337 nm的中等強度氫鍵；而五元糖環能與THR449和SER452等關鍵氨基酸形成至少4個氫鍵(圖4(b)).正是如此多的相互作用才使該化合物在口袋B上對NS3解旋酶具有很強的結合能力.

2) dimeric terrestrols(MNPD001354)：該化合物由Chen等[33]于2008年從海洋真菌青霉菌(Penicilliumterrestre)中分離得到，其分子結構特征也與N-(4-氯乙基)肼甲酰胺化合物類似，但結合能較低(-28.558 kJ/mol).其苯環上的4個羥基均能與口袋B的關鍵極性氨基酸(如GLU413和SER452等)形成強氫鍵(鍵長0.276～0.313 nm)，這與aromatic polyketides類似(圖4(c));但由于疏水作用對象由萘環變為苯環，該部分的貢獻值降低，這也是該化合物的結合能高于aromatic polyketides的根本原因.

3) 6-(methylamino)-3,7-dihydro-2H-purin-2-one(MNPD005912)：該化合物可以看作2-hydroxy-6-methylaminopurine的互變異構體.該化合物在口袋B上的結合能卻比在口袋A上的要低6.808 kJ/mol，說明該化合物可以選擇性地結合到口袋B而非口袋A.雖然此類化合物的分子質量較小，但是相互作用分析表明：它與口袋B的關鍵且保守極性氨基酸(如THR449和HID288等)可形成5個強氫鍵(圖4(d))，遠超過與口袋A的3個氫鍵;此外，口袋B的芳香性氨基酸TRP487能與其五六元環存在π-π堆積作用，這也是它具有結合位點偏好性的根本原因.

4) 4,5-dibromopyrrole-2-carbonamide(MNPD000526)：該化合物早期從海綿Agelasdendromorpha中獲得[34]，雖具有芳香性基團，但由于溴原子參與形成氫鍵的能力較弱(圖4(e))，其結合能(-25.900 kJ/mol)略高于6-(methylamino)-3,7-dihydro-2H-purin-2-one.

5)R-allantoin(MNPD001587)：該化合物從沿海植物紫草(Mertensiamaritima)中分離得到[35]，雖然有氫鍵給體與受體能力，但是分子沒有芳香性且分子體積較小，無法達到與極性氨基酸相互作用的程度(圖4(f))，這也是它結合能較高的根本原因.

綜上，口袋B的虛擬篩選結果表明：此口袋偏好芳香性官能團及氫鍵給體與受體官能團;同時口袋B屬于隧道形結構，因此無法容納分子體積較大的分子，這也是它與具有表面結合性質的口袋A不同的地方.

2.3 篩選化合物的ADMET預測與分析

對上述10個海洋天然產物進行藥物ADMET(即吸收、分配、代謝、排泄和毒性)預測分析，結果表明(表1)：大部分化合物滿足成藥性的各項指標要求，但divanchrobactin (MNPD001378)的成藥性偏差，有3條違反成藥五原則.其屬于擬四肽，氫鍵給體與受體偏多，且在代謝過程中極有可能發生代謝反應，口服吸收利用率低，雖然它能很好地與口袋A結合，但是從成藥性來看反而不是最佳的化合物.而與口袋B結合最好的化合物aromatic polyketides(MNPD001827)有人類果蠅相關基因(hERG)編碼的K+通道阻斷的風險，可能具有一定的心臟毒性.R-allantoin(MNPD001587)的QPPCaco值低于25，暗示該化合物經過腸道吸收不好.而另外2個化合物4,5-dibromopyrrole-2-carbonamide(MNPD000526)與MNPD004936的腸道吸收指標都很好(QPPCaco值大于500)，這也與它們對應有較高的人體口服吸收度(80.260%和89.293%)一致.

3 結 論

本研究針對寨卡病毒NS3 解旋酶的2個新穎結合位點，運用分子對接技術對包含5 969個海洋天然產物的自建庫開展虛擬篩選，并根據打分函數及結構多樣性的原則，挑選了10個化合物進行對接口袋的詳細分析，結果發現這些化合物的結合方式與報道的碎片分子一致，但結合能力卻有大幅度提升，暗示它們可以更好地靶向NS3解旋酶，從而成為潛在治療寨卡病毒病的海洋天然產物；且初步的成藥性評估表明除divanchrobactin(MNPD001378)外，本文中所述的海洋天然產物都滿足成藥性要求，為后期這些化合物進行實驗測試提供了理論支撐.

致謝：薛定諤公司提供了薛定諤軟件套裝，海洋天然產物庫由劉詩婷、楊燦原、鞠芮及王鑫構建提供，在此一并感謝.