染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)及其應(yīng)用

王遠(yuǎn)锏

摘? ?要：染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)是一種利用抗原抗體結(jié)合的特異性來檢測蛋白質(zhì)與基因互作的技術(shù)，具有高效率但是低重復(fù)性的特點，影響實驗結(jié)果分辨率的因素包括檢測樣品使用量、DNA片段斷裂程度、抗體親和性等。隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展，其應(yīng)用范圍也逐漸擴(kuò)大到如DNA測序、蛋白質(zhì)修飾、對細(xì)胞類型特異性串聯(lián)染色質(zhì)表觀遺傳修飾研究等方面，并逐步與如高通量測序技術(shù)、免疫熒光技術(shù)等其他研究手段相結(jié)合，在蛋白質(zhì)尤其是組蛋白及其修飾產(chǎn)物與DNA互作研究領(lǐng)域發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：染色質(zhì)免疫技術(shù)? 蛋白質(zhì)基因互作

中圖分類號：R446? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：1674-098X（2019）07（a）-0120-02

目前研究蛋白質(zhì)與DNA互作的手段較多，其中染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)是一種可以在體內(nèi)活性環(huán)境下測定基因與蛋白互作的手段，自該技術(shù)創(chuàng)建以來，從單個蛋白與DNA互作、數(shù)個蛋白與DNA互作進(jìn)而發(fā)展到目的蛋白與未知序列互作的研究，進(jìn)一步延伸出檢測組蛋白修飾與DNA片段測序應(yīng)用，再與免疫熒光技術(shù)、高通量測序技術(shù)、基因芯片技術(shù)等相結(jié)合，在其他研究領(lǐng)域也有著廣泛應(yīng)用。

1? 染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)原理

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Chromatin immunoprecitation， ChIP）是一種利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)在生理狀態(tài)下測定蛋白質(zhì)與DNA互作的技術(shù)。首先將研究的細(xì)胞進(jìn)行固定化，常用的固定化手段是使用福爾馬林固定，再使細(xì)胞維持在一個自然穩(wěn)定的狀態(tài)，同時甲醛還可以將將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)行交聯(lián)，以便于進(jìn)一步操作。之后將DNA打斷成為200～1000bp的片段，可以使用超聲波處理隨機(jī)將DNA打破，也可以使用核酸酶特異性酶切長鏈。使用特異性抗體將與蛋白質(zhì)相互結(jié)合的DNA片段進(jìn)行沉淀，得到的沉淀進(jìn)行進(jìn)一步純化。之后使用如蛋白酶K[1]等手段將沉淀進(jìn)行解交聯(lián)并使用層析等純化DNA片段，以便于進(jìn)一步對目標(biāo)DNA進(jìn)行擴(kuò)增與分析。之后使用PCR等對得到的DNA片段構(gòu)建其相應(yīng)的測序文庫，最后使用高通量測序技術(shù)對DNA進(jìn)行測序，分析與蛋白的結(jié)合位點。最后對蛋白與DNA的結(jié)合位點進(jìn)行驗證。

2? 影響ChIP檢測結(jié)果的因素

ChIP可重復(fù)性較低，干擾因素較多，主要是影響DNA片段、蛋白質(zhì)交聯(lián)體與相應(yīng)抗體的結(jié)合程度，包括檢測樣品使用量、DNA片段斷裂程度、抗體親和性等方面。樣品使用量直接影響的是DNA與蛋白交聯(lián)體破碎程度與抗體結(jié)合底物量，當(dāng)樣品使用量過大時，對DNA的破碎程度不夠，在進(jìn)一步的抗原抗體結(jié)合沉淀與DNA測序等過程均有較大影響。DNA片段的斷裂程度主要由處理手段決定，常見的如超聲波處理斷裂DNA片段中，超聲波破碎儀器的型號、超聲波的頻率等就是常見的影響ChIP檢測結(jié)果的因素。不同的超聲波破碎儀的工作原理、工作最佳條件不同，將影響底物破碎程度，張媛媛[2]等人的研究對三種不同型號的超聲波破碎儀 Bandelin Sonopuls HD 2070，Covaris M220 Focused-ultrasonicator、Bioruptor Plus.其中 Bandelin sonopuls HD 2070 為探頭式超聲破碎儀，而其他兩種破碎儀器為非接觸式超聲破碎儀，且后者的破碎效果更好，CHIP檢測結(jié)果分辨率更高。超聲波的頻率、處理時間與次數(shù)對ChIP實驗結(jié)果也有明顯影響，房艷華[3]等人對斜臥青霉轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Hac1進(jìn)行實驗，在最佳菌絲用量為1g菌絲/10mL ChIP緩沖液下，25W超聲功率，工作時間5s，間隔時間40s，超聲30次可以得到最佳分辨率的分析結(jié)果?？贵w親和性也是影響結(jié)果的重要因素之一，一般ChIP實驗需要使用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒或者已經(jīng)經(jīng)試驗證明有效的抗體，對于未檢測過的抗體最好使用IP/IHC/ICC進(jìn)行檢測[4]。另外，部分抗體受染色質(zhì)溶液中的抑制因子影響較大，因此需要對抗體的用量和染色質(zhì)溶液比例進(jìn)行調(diào)整。

3? 染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的應(yīng)用

ChIP及其衍生技術(shù)目前在蛋白質(zhì)-DNA互作、DNA測序、蛋白質(zhì)尤其是組蛋白的修飾研究、細(xì)胞類型特異性串聯(lián)染色質(zhì)表觀遺傳修飾研究等方面均有廣泛應(yīng)用。在蛋白質(zhì)-DNA互作方面，孫瑞[5]等人通過染色質(zhì)免疫共沉淀確定了對核盤菌中Forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子成員SsFox-E2可以參與調(diào)控核盤菌的有性生殖，進(jìn)而對子囊盤的發(fā)育產(chǎn)生影響。組蛋白與DNA直接組裝成核小體并影響著基因表達(dá)，組蛋白修飾基團(tuán)的變化將直接影響其與DNA的結(jié)合情況并影響基因表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物量的大小，王文靜[6]等利用ChIP確定組蛋白結(jié)合的DNA片段序列，PCR擴(kuò)增并經(jīng)過電泳檢測確定組蛋白H3K9m2和H3K4m3是可能引起miR-338-3p下調(diào)的，進(jìn)而引起如食道癌等疾病的發(fā)生。在檢測復(fù)雜組織中特異性細(xì)胞表觀遺傳修飾領(lǐng)域ChIP也發(fā)揮著重要作用，Mari Mito等人針對高等真核生物神經(jīng)系統(tǒng)設(shè)計出了一種串聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀測序（tchip-Seq），這種手段通過使一種染色質(zhì)組分FLAG-標(biāo)記組蛋白h2b在Camk2a陽性錐體細(xì)胞中表達(dá)，并以細(xì)胞類型特異性的方式純化染色質(zhì)。針對一種主要與活性啟動子相關(guān)的染色質(zhì)修飾H3K4me3使用抗體的染色質(zhì)免疫沉淀，從而觀察Camk2a陽性錐體細(xì)胞中組蛋白修飾情況。通過這種手段在與神經(jīng)元功能相關(guān)與關(guān)系未知的基因上游發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個H3K4me3，以此證明這種串聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀測序可以做為一種研究體內(nèi)特定細(xì)胞類型表觀遺傳修飾的通用方法。

參考文獻(xiàn)

[1] 吳彤， 王瑞明， 黃磊，等. 蛋白酶K的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技， 2013， 34（14）：380-384.

[2] 張媛媛，黃冬梅，鄧班，等.植物葉片染色質(zhì)免疫共沉淀方法的優(yōu)化[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2018，47（3）：329-335.

[3] 房艷華， 韋小敏， 李肖，等. 斜臥青霉轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Hac1染色質(zhì)免疫共沉淀分析方法的建立[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版， 2018（3）.

[4] NISHIKORI S，HATTORI T，F(xiàn)UCHS S M，et al. Broad ranges of affinity and specificity of anti-histone antibodies revealed by a quantitative peptide immunoprecipitation assay[J].Journal of Molecular Biology，2012，424（ 5） ： 391-399.

[5] Mito M ， Kadota M ， Tanaka K ， et al. Cell Type-Specific Survey of Epigenetic Modifications by Tandem Chromatin Immunoprecipitation Sequencing[J]. Scientific Reports， 2018， 8（1）：1143.