RNAi沉默SDF-1基因對新誘導建立的人胃癌耐藥細胞系SGC7901/L-OHP的影響

劉小慧 賀曼曼 張 偉 李 靜 郭明海 馮運章

胃癌是消化系統惡性腫瘤，起病隱匿，80%以上的胃癌患者被診斷時已處于進展期，單純手術治療預后不理想[1]。目前進展期胃癌已形成以手術為主，聯合化療、放療、靶向、免疫等措施的綜合治療模式。新輔助化療、轉化治療或術后輔助化療均能改善部分患者總體生存期[2]。奧沙利鉑(oxaliplatin，L-OHP)是胃癌化療核心藥物,但臨床上常見到對其耐藥的患者[3,4]。胃癌異質性極強，一旦腫瘤細胞耐藥嚴重影響化療效果，最終導致腫瘤復發和轉移。因此，深入研究腫瘤細胞耐藥意義重大，而體外建立耐藥細胞系是研究細胞耐藥的重要模型。基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor- 1，SDF-1)是一種炎性趨化因子，與其特異性受體CXCR4結合后參與介導炎性和免疫反應、調控造血、血管生成、惡性腫瘤的浸潤轉移等多種病理生理過程[5]。目前有研究報道SDF-1高表達與白血病、卵巢癌、肺癌細胞化療耐藥密切相關[6～8]。但胃癌細胞耐藥中SDF-1是否發揮作用鮮有報道。因此本研究旨在誘導建立對L-OHP耐藥的胃癌細胞系SGC7901/L-OHP，觀察其生物學行為變化，并在此基礎上應用RNAi技術沉默SDF-1基因表達，探討SDF-1基因對胃癌耐藥細胞系SGC7901/L-OHP增殖、凋亡、耐藥的影響及可能機制。

材料與方法

1.材料:(1)細胞株：胃癌細胞株SGC7901購自中國科學院上海細胞研究所。(2)主要試劑、藥物：兔抗人SDF-1單克隆體抗(Abcam公司，ab155090)；轉染試劑盒Lipofectamine-2000、Trizol Reagent(美國 Invitrogen 公司)；cDNA 合成試劑盒(美國Fermentas公司)；全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物公司)；MTT試劑盒、溴化乙錠(美國Sigma公司)。實驗相關PCR引物均由上海生物工程有限公司合成；SDF-1小干擾RNA質粒由上海吉瑪制藥有限公司合成。奧沙利鉑(50毫克/支，武漢醫藥有限公司)。

2.奧沙利鉑耐藥胃癌細胞系的誘導構建及生物學行為變化:(1)奧沙利鉑耐藥胃癌細胞系的構建與評定:人胃癌細胞株SGC7901常規培養傳代。采用高濃度間歇沖擊誘導法：預實驗檢測SGC7901細胞IC50約為10μg/ml，取對數生長期細胞與1μg/ml(1/10 IC50)的L-OHP在培養箱共孵育24h，棄培養液，PBS清洗，換新鮮培養液，待細胞恢復生長后，增加藥量為2μg/ml(1/5 IC50)，重復上述步驟，根據存活耐藥細胞恢復對數生長的時間，間歇縮短給藥時間并增大藥物濃度，分別為5、10、20、40、80μg/ml，歷時5.5個月，最終誘導能在10μg/ml的L-OHP共培養基中穩定生長的細胞，MTT檢測并計算其耐藥指數(resistance index，RI)為5.5，經多次冷凍復蘇其耐藥指數均較為恒定，命名為SGC7901/L-OHP。下述實驗開展前細胞均脫藥培養2周。(2)觀察SGC7901/L-OHP形態學變化:①倒置顯微鏡觀察：SGC7901與SGC7901/L-OHP收集接種至24孔培養板，培養48h后倒置顯微鏡拍照觀察；②透射電鏡觀察：收集兩種細胞，經固定、脫水、包埋、切片、染色，透射電鏡拍照觀察。(3)細胞計數法繪制生長曲線：取對數生長期的細胞約2×104個，培養于24孔板，設3個復孔，用細胞計數板每天計數3個孔細胞數，取平均值，共觀察6天，繪制細胞生長曲線，并計算兩種細胞群體倍增時間(TD)。(4)MMT法檢測L-OHP對SGC7901、SGC7901/L-OHP細胞增殖的影響：各取對數期細胞約2×104個，培養于96孔板，24h后分別按照L-OHP(1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0μg/ml)濃度梯度加藥，每種濃度設3個復孔，培養48h后每孔加入MTT溶液(濃度5mg/ml)20μl，37℃培養4h，棄上清, 加100μl的DMSO，自動酶標儀測定各孔570nm波長吸光度值，分別計算兩種細胞增殖抑制率[增殖抑制率=(1-用藥組A/對照組A)×100%]。SPSS軟件計算IC50值。實驗重復5次。(5)流式細胞術檢測SGC7901與SGC7901/L-OHP細胞周期變化:各取對數期細胞，0.25%胰酶消化后調整細胞密度為1×106/ml，設3個復孔，離心，棄上清，PBS洗滌，70%乙醇固定，4℃過夜，PBS洗滌3次，再離心，棄上清及乙醇，加碘化丙啶染液500μl，4℃避光反應30min，上機檢測。實驗重復5次。(6)RT-PCR檢測SDF-1 mRNA表達:按2×107收集對數期兩種細胞，Trizol法提取細胞總RNA，按試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA，配置25μl反應體系擴增目的基因。引物序列：SDF-1,上游引物(5′→3′):GGGTACCATGCAGCTTGTTG；下游引物(5′→3′):GAGATCTCTAGGCGCCCTGG。GAPDH,上游引物(5′→3′): AGAAGGCTGGGGCTCATTTG；下游引物(5′→3′):AGGGGCCATCCACAGTCTTC。RT-PCR反應條件：預變性94℃5min→94℃變性30s→(SDF-1，55℃；GAPDH，58℃)退火60s→72℃延伸1min,擴增30個循環。SDF-1 mRNA相對表達強度=IOD(SDF-1)/IOD(GAPDH)。實驗重復5次。(7)Western blot法檢測SDF-1蛋白表達：分別收集2×107個細胞提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，50μg蛋白上樣，經SDS-PAGE電泳分離，轉PVDF膜。20ml封閉液室溫搖床孵育1.5h,棄封閉液，一抗孵育(兔抗人SDF-1單抗)，4℃孵育過夜后洗膜，按1∶3000稀釋倍數加入辣根酶標記的二抗，室溫搖床孵育1.5h。洗膜后用紅外熒光掃描成像系統掃描，以GAPDH作為內參計算SDF-1蛋白相對表達強度。實驗重復5次。

3.SDF-1-RNAi轉染后SGC7901/L-OHP生物學行為的變化:(1)SDF-1-RNAi的合成、實驗分組及轉染:SDF-1-RNAi由上海吉凱基因化學技術有限公司合成，其序列(5′→3′)：GTGCATTGACCCGAAGCTAAATCAAGAGTTTAGCTTCGGGTCAATG-CACTTTTT。非特異性序列(5′→3′)：GATCCGAC-GAGTTGACTGCGATTGTTCAAGAGACAATCGCAGTC-AACTCGTCGTCAGA。實驗分3組，即空白對照組(細胞不經任何處理)、陰性對照組(轉染非特異性序列質粒)和SDF-1-RNAi組(轉染SDF-1-RNAi質粒)。細胞接種于6孔板，融合度80%左右時通過Lipofectamine 2000進行轉染。轉染48h后檢測轉染效率并進行后續實驗。后續實驗均重復5次。(2)RT-PCR、Western blot法檢測SDF-1表達情況:RT-PCR及Western blot法具體實驗步驟同前，檢驗轉染后3組細胞SDF-1 mRNA和蛋白表達，驗證沉默效果。(3)MTT法檢測3組細胞增殖抑制率變化:MTT實驗步驟同前，檢測轉染后48h 3組細胞增殖及耐藥性變化。(4)流式細胞儀檢測3組細胞凋亡率及細胞周期變化:具體操作同前，凋亡率檢測按照試劑盒說明書進行，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率及周期分布。

結 果

1.SGC7901/L-OHP形態學改變:5.5個月后成功誘導建立SGC7901/L-OHP，倒置顯微鏡下觀察，與親本細胞比較，最終建立的耐藥細胞形態變得不規則，變細變長，可見梭形、長條形、三角形細胞，并可見較多漂浮細胞，生長分布比較均勻，聚集生長現象不明顯(圖1)。透射電鏡下觀察SGC7901細胞核清晰，核仁明顯，細胞形態規則，表面見豐富微絨毛。SGC7901/L-OHP細胞核相對增大，細胞質空泡結構明顯增多，細胞形態不規則，表面微絨毛較少(圖2)。

圖1 SGC7901和SGC7901/L-OHP倒置顯微鏡觀察A.SGC7901(×100)；B.SGC7901(×200)；C.SGC7901/L-OHP(×100)；D.SGC7901/L-OHP(×200)

圖2 SGC7901和SGC7901/L-OHP透射電鏡觀察A.SGC7901(×5000)；B.SGC7901/L-OHP(×5000)

2.SGC7901/L-OHP生長曲線及倍增時間：細胞計數法記錄兩種細胞每日細胞數，以時間為橫軸，細胞數為縱軸，繪制生長曲線(圖3)。經公式計算SGC7901與SGC7901/L-OHP的群體倍增時間分別為23.56±1.44h、27.83±1.67h。與SGC7901比較，SGC7901/L-OHP群體倍增時間明顯延長(P<0.05)，耐藥細胞增殖明顯減慢。

圖3 SGC7901和GC7901/L-OHP細胞生長曲線

3.SGC7901/L-OHP對L-OHP的耐藥性變化：由圖4可見，隨著L-OHP濃度的升高，兩種細胞增殖抑制率均明顯升高，但在L-OHP相同濃度下，SGC7901/L-OHP細胞增殖抑制率明顯低于SGC7901(P均<0.05)。SGC7901的IC50為10.424±1.193μg/ml，SGC7901/L-OHP IC50為57.405±2.158μg/ml，RI為5.5。Snow等研究認為，細胞耐藥分為低度耐藥(RI<5)、中度耐藥(RI 5～15)和高度耐藥(RI>15)。依此標準本實驗成功建立中度耐藥細胞系SGC7901/L-OHP,且多次冷凍復蘇后復測耐藥指數恒定。

圖4 奧沙利鉑對SGC7901與SGC7901/L-OHP的細胞抑制率比較與SGC7901比較，*P<0.05

4.SGC7901與SGC7901/L-OHP細胞周期分布情況:流式細胞儀檢測結果顯示，與SGC7901比較，SGC7901/L-OHP的G0/G1期細胞比例顯著升高(P<0.01)，S期細胞比例顯著減低(P<0.01)，G2/M期細胞比例無變化(P>0.05，表1，圖5)。

表1 SGC7901與SGC7901/L-OHP細胞周期分布

與SGC7901比較，*P<0.05

圖5 SGC7901與SGC7901/L-OHP細胞周期分布

5.SGC7901與SGC7901/L-OHP中SDF-1表達情況:RT-PCR結果顯示，SGC7901/L-OHP細胞中SDF-1 mRNA的表達量明顯高于SGC7901細胞(1.367±0.173 vs 0.750±0.104,t=6.833,P<0.01)。Western blot法檢測結果顯示，SGC7901/L-OHP細胞中SDF-1蛋白的表達量明顯高于SGC7901細胞(1.647±0.220 vs 1.255±0.158,t=3.226,P<0.05,圖6)。

圖6 兩種細胞株中SDF-1 mRNA及蛋白的表達情況a.SGC7901；b.SGC7901/L-OHP

6.SDF-1-RNAi轉染后SDF-1的表達:RT-PCR結果顯示SDF-1-RNAi轉染48h后，空白對照組、陰性對照組、SDF-1-RNAi組SDF-1 mRNA表達量分別為1.367±0.178、1.336±0.225、0.328±0.035，轉染組與空白、陰性對照組比較差異均有統計學意義(F=62.843，P<0.01)，空白與陰性對照組比較差異無統計學意義，表明siRNA-SDF-1成功沉默了SDF-1 mRNA的表達。Western blot法檢測結果顯示，空白對照組、陰性對照組、SDF-1-RNAi組SDF-1蛋白表達量分別為1.655±0.282、1.583±0.263、0.242±0.024，SDF-1-RNAi組與空白、陰性對照組比較差異均有統計學意義(F=64.147，P<0.01)，空白與陰性對照組比較差異無統計學意義，從蛋白水平也印證了siRNA-SDF-1成功沉默了SDF-1蛋白的表達(圖7)。

圖7 轉染后3組細胞SDF-1 mRNA和蛋白表達情況A.空白對照組；B.陰性對照組；C.SDF-1-RNAi組

7.SDF-1-RNAi轉染后SGC7901/L-OHP細胞增殖抑制率及化療敏感度變化：轉染48h后MTT檢測結果顯示，隨著L-OHP濃度的遞增，3組細胞的增殖抑制率均明顯升高。在L-OHP相同濃度下，SDF-1-RNAi組細胞的增殖抑制率明顯高于空白、陰性對照組(P均<0.05)，陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義，提示沉默SDF-1后SGC7901/L-OHP增殖受到明顯抑制。同時，SDF-1-RNAi組IC50(20.512±1.666)明顯低于空白及陰性對照組(55.565±2.345，53.030±2.458，P<0.05)，耐藥指數明顯降低(圖8)。

圖8 奧沙利鉑對各組細胞增殖抑制率的比較與空白、陰性對照組比較，*P<0.05

8.SDF-1-RNAi轉染后SGC7901/L-OHP細胞凋亡率的變化:轉染48h后流式細胞儀檢測結果顯示，SDF-1-RNAi組細胞凋亡率明顯高于空白及陰性對照組(P均<0.05)，空白對照組與陰性對照組凋亡率比較差異無統計學意義(P>0.05，表2)。

表2 3組細胞凋亡率及細胞周期分布的比較

與空白、陰性對照組比較，*P<0.05

9.SDF-1-RNAi轉染后SGC7901/L-OHP細胞周期分布變化:流式細胞儀檢測結果(表2，圖9)顯示，與空白及陰性對照組比較，SDF-1-RNAi組細胞被阻滯于S期，S期細胞比例顯著增加(F=17.584，P<0.01)，G0/G1期細胞比例顯著降低(F=37.193，P<0.01)，G2/M期細胞比例無變化(F=0.822，P>0.05)。空白對照組與陰性對照組比較，各期細胞比例均衡，差異無統計學意義(P均>0.05)。

圖9 流式細胞儀檢測3組細胞的細胞周期分布A.空白對照組；B.陰性對照組；C.SDF-1-RNAi組

討 論

我國胃癌發生率位居惡性腫瘤第4位，病死率居第2位,其中約90%發現時已到進展期，即使手術治療,5年生存率仍低于30%[9,10]。擴大手術切除范圍和術后輔助化療依舊是提高胃癌術后生存率的主要手段[11]。XELOX方案或SOX方案是胃癌一線化療方案，核心藥物均包含奧沙利鉑。奧沙利鉑通過鉑原子與DNA形成鏈內交聯、鏈間交聯及蛋白質交聯，從而損傷DNA[3]。然而在治愈腫瘤或顯著延長患者生存期方面，化療效果并不理想，化療過程中存活腫瘤細胞的再增殖及腫瘤細胞的耐藥性是導致化療失敗的關鍵[12]。有鑒于此，對腫瘤細胞耐藥及逆轉耐藥的研究始終是一種熱潮。體外建立耐藥細胞系是研究腫瘤耐藥的基礎，通常采用低濃度持續誘導和高濃度間歇沖擊兩種方法構建。

李彩麗等[13]分別采用上述兩種方法誘導建立大腸癌耐藥細胞系SW480/OXP，認為高濃度間歇沖擊法具有誘導時相短以及構建的細胞系耐藥性更穩定的優點。因此本研究采用大劑量間歇沖擊誘導法，歷時5.5個月成功建立人胃癌奧沙利鉑中度耐藥細胞系SGC7901/L-OXP。從光鏡下觀察，與SGC7901細胞比較，SGC7901/L-OXP細胞形態不規則，細胞細長，可見梭形、長條形、三角形細胞。文俏程等[14]研究認為SGC7901/L-OXP細胞的這種形態改變屬于上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，EMT可能是人胃癌細胞對 L-OHP 產生耐藥的重要機制。生長曲線分析顯示SGC7901/L-OXP細胞增殖變緩，倍增時間較SGC7901細胞延長約4h。而細胞倍增時間越長其對化療藥物越不敏感[15]。MTT結果顯示在L-OHP相同濃度作用下，SGC7901/L-OHP細胞增殖抑制率明顯低于SGC7901，表明耐藥細胞對L-OHP藥物敏感度明顯降低。同時，與SGC7901細胞比較，SGC7901/L-OHP細胞周期分布發生改變，G0/G1期細胞升高，S期細胞減少，G2/M期細胞無變化。一般的化療藥物只對增殖期細胞敏感，對G0期細胞效果相對較差[9]，這可能是人胃癌SGC7901細胞對 L-OHP 產生耐藥的另一個重要原因。

SDF-1是一種炎性趨化因子，與其配體 CXCR4 廣泛表達于人體多種細胞和組織，在白血病、卵巢癌、肺癌等惡性腫瘤增殖、侵襲、轉移、耐藥中均發揮重要作用[6～8]。SDF-1能夠誘導ERK磷酸化,上調Bcl-xL的表達進而降低ALL細胞株SUP-B15對阿霉素的敏感度,保護白血病細胞耐受化療[6]。SDF-1能促進卵巢癌細胞增殖與克隆，提高其同源重組修復能力，介導順鉑耐藥[7]。腫瘤相關成纖維細胞通過分泌SDF-1提高Bcl-xL的表達，增強肺癌A549細胞對順鉑的耐藥性[8]。此外，沈照華等[16]發現SDF-1/CXCR4軸能促使白血病成骨龕基質細胞層包裹白血病細胞形成“庇護所”樣結構，促使白血病細胞滯留于靜止期，屏蔽阿糖胞苷的殺傷，而阻斷SDF-1/CXCR4軸活性后，靜止期細胞脫離成骨龕，對化療藥物敏感度增加，細胞凋亡增加。

本實驗結果顯示，SGC7901/L-OHP細胞中SDF-1 mRNA和蛋白的表達量明顯高于SGC7901細胞，提示SDF-1高表達參與了SGC7901對L-OHP獲得性耐藥過程。應用RNAi技術沉默SDF-1表達后，SDF-1-RNAi組細胞SDF-1 mRNA和蛋白的表達量顯著低于空白、陰性對照組，表明SDF-1-RNAi能夠有效沉默SDF-1基因。在此基礎上MTT結果顯示，在相同L-OHP濃度作用下，SDF-1-RNAi組細胞增殖抑制率明顯高于空白及陰性對照組，且其IC50值明顯降低，表明沉默SDF-1能夠有效抑制SGC7901/L-OHP細胞增殖，提高其對L-OHP的藥物敏感度，部分逆轉耐藥。目前研究認為EMT與腫瘤侵襲轉移耐藥均有關聯，而SDF-1對EMT具有正向促進作用[17～20]。SDF-1高表達能促進結直腸癌細胞、膽管癌RBE細胞EMT進程，促進侵襲轉移[18，19]。

SDF-1可以通過MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路上調膠質母細胞瘤U-251 細胞Survivin基因表達，進而調控細胞周期進展并促進EMT[20]。動物實驗研究表明，SDF-1能促進G0/G1期兔膝關節軟骨細胞進入增殖周期，促進其體外增殖并抑制凋亡[21]。本實驗沉默SDF-1表達后發現，與對照組比較，SDF-1-RNAi組細胞增殖受限，凋亡率增加，且細胞周期分布發生改變，表現為G0/G1期細胞減少，S期細胞增多，細胞周期阻滯于S期。由此推測SDF-1促進SGC7901/L-OHP細胞增殖的靶點可能位于S期進入G2/M期的“關卡”上，當沉默SDF-1表達后細胞阻滯于S期，細胞增殖受限，并可能通過抑制Survivin、Bcl-xL的表達導致細胞凋亡增加。同時SDF-1基因沉默導致細胞EMT進程受阻，G0/G1期細胞失去間質化細胞的“庇護”，進入S期，在L-OHP的作用下大量壞死，從而提高了L-OHP的藥物敏感度。

綜上所述，本研究成功構建了人胃癌奧沙利鉑中度耐藥細胞系SGC7901/L-OHP，并通過RNAi技術沉默SDF-1基因表達，發現能夠抑制細胞增殖，阻滯細胞周期進程，并促進細胞凋亡，提高細胞對L-OHP的敏感度，部分逆轉耐藥性。今后SDF-1有望成為逆轉腫瘤耐藥的一個靶點。