血管鈣化大鼠模型Apelin 及其受體表達的實驗研究

曾憲欽，張旭升，樊小容，黃戰軍，蔡博治，張 昕

Apelin 是于1998 年發現的孤兒G 蛋白耦聯受體-血管緊張素受體樣蛋白J 受體( APJ) 的內源性配體，是一種新的脂肪因子，具有心血管保護、抗肥胖和抗糖尿病等作用［1］。而血管鈣化是動脈粥樣硬化、糖尿病和高血壓等多種常見心血管疾病的病理生理基礎，研究發現血管鈣化是主動的、可調節的過程［2］，許多血管活性因子參與血管鈣化的過程，本課題組前期實驗亦發現一些心血管活性因子參與血管鈣化的發生和發展，如尾加壓素Ⅱ、Salusins 及醛固酮［3-5］等，但血管鈣化確切機制十分復雜，因此發現新的活性因子對血管鈣化的機制研究及防治具有重要意義。Apelin 作為一種新的脂肪因子，能夠參與血管炎癥和動脈粥樣硬化的過程，但其在血管鈣化中的作用尚不清楚。為此，本實驗在大鼠血管鈣化模型基礎上，觀察Apelin 及其受體在血漿和血管組織中的表達，初步探討Apelin 及其受體在血管鈣化中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥品 8 周齡雄性SD 大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。尼古丁購自Merck公司，維生素D3購自Sigma 公司，鈣離子測試盒、堿性磷酸酶( ALP) 試劑盒購自南京建成生物工程研究所;Apelin Elisa 試劑盒購自武漢華美; APJ 一抗購自Novus Biologicals; 二抗購自基因科技( 上海) ; 其余為進口或國產分析純試劑。

1.2 鈣化動物模型制備 參照文獻［3］制備大鼠血管鈣化模型，取16 只雄性 SD 大鼠( 160～180 g) ，隨機分為鈣化組與正常組，每組8 只。鈣化組: 08: 00 肌肉注射維生素D33×105U/kg，同時將尼古丁25 mg /kg 溶于1 mL 花生油灌胃，18: 00 時重復灌胃1 次。正常組: 類似鈣化組操作，但肌肉注射生理鹽水和灌胃單純花生油。兩組大鼠常規飼養4 周后，用3%水合氯醛腹腔麻醉，心臟取血處死，血液置入含有促凝劑的5 mL塑料試管中，充分混勻，4 ℃離心分離血清。摘取胸主動脈，用冰生理鹽水沖洗后，部分動脈組織石蠟包埋，用于染色，其他用錫紙包裹，－80 ℃儲存待測。

1.3 Von Kossa 染色 將大鼠胸主動脈組織進行石蠟包埋、切片，行常規脫蠟、脫水后浸泡在5%的硝酸銀溶液中，紫外線下照射30 min，再用2.5%的硫代硫酸鈉溶液處理1 min 定影，然后用0.25%堿性品紅復染，經脫水、透明、封片，在光鏡下觀察組織形態和鈣鹽沉積情況。

1.4 血管組織ALP 活性及鈣含量測定 將大鼠主動脈組織勻漿，4 ℃離心，取上清以考馬斯亮藍法行蛋白定量。分別按照ALP 測定試劑盒( 磷酸苯二鈉法) 及鈣測試盒( 甲基百里香酚藍比色法) 說明書測定ALP活性及鈣含量。

1.5 Apelin 含量的測定 準備好血清及主動脈勻漿液; sample diluent 稀釋好樣品及Apelin 標準品，均勻加入包被Apelin 抗體的小孔中。依次溫育生物素標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液、底物溶液及終止溶液。最后使用酶標儀450 nm 波長測量OD 值。具體步驟參照說明書操作。

1.6 免疫組織化學法檢測主動脈組織中APJ 的表達采用4%多聚甲醛固定胸主動脈，石蠟包埋，連續切片制作4 μm 厚切片，取出切片64 ℃烤片15 min; 二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ每缸10 min; 100%酒精Ⅰ、100%酒精Ⅱ、95%酒精、85%酒精、75%酒精，每缸5 min; 流水沖洗5 min; 4%過氧化氫封閉15 min，磷酸緩沖鹽溶液( PBS)洗3 次，每次5 min; 10%牛血清白蛋白( BSA) 血清封閉30 min; 棄去封閉液加入一抗4 ℃過夜; 棄去一抗PBS 洗 3 次，每次 5 min; 加二抗室溫 1 h，PBS 洗 3 次，每次5 min; 二氨基聯苯胺( DAB) 染色鏡下觀察，流水沖洗5 min; 蘇木素10 min，1%鹽酸酒精3 s，流水沖洗5 min; 中性樹膠封片觀察。

1.7 統計學處理 采用Graph Pad Prism 4 統計軟件進行統計學處理。計量資料以均數±標準差( x ±s ) 表示，組間比較采用t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血管鈣化大鼠模型的特征 Von Kossa 染色可見主動脈中膜彈性纖維間黑色顆粒沉積，表明鈣鹽沉積。詳見圖1。

圖1 大鼠主動脈Von Kossa 染色( ×40)

2.2 大鼠主動脈組織鈣含量、ALP 活性的變化 鈣化組主動脈鈣含量及ALP 活性明顯高于正常組( P ＜0.01) 。詳見表 1。

表1 兩組主動脈鈣含量與血管ALP活性比較( x ±s )

2.3 大鼠血清和主動脈組織Apelin 含量的變化 鈣化組血清和主動脈組織中Apelin 的表達明顯低于正常組( P ＜0.01) 。詳見表 2。

表2 血清和主動脈組織Apelin 表達比較( x ±s )

2.4 大鼠主動脈組織中的APJ 表達的變化 免疫組化染色顯示，鈣化組主動脈組織APJ 表達明顯低于正常組。詳見圖2。

圖2 APJ 免疫組化染色( ×100)

3 討 論

血管鈣化是一個主動、可調節的過程，其中血管平滑肌細胞由收縮表型轉變為成骨細胞樣表型是血管鈣化的基礎，從而分泌多種骨相關蛋白和活性因子調節血管鈣化的發生和發展。臨床上，在多種病理情況下如高血壓、高血糖以及高脂血癥等，可導致血管功能受損，可能為血管鈣化始動因素或促進因素。近年來調節血管功能的活性因子，尤其是血管組織產生的旁/自分泌活性肽或活性因子成為目前研究的熱點。很多血管活性因子( 如尾加壓素Ⅱ、Salusin 和醛固酮等) 、炎癥因子［如白細胞介素-6( IL-6) 、單核細胞趨化蛋白-1( MCP-1) 及 C 反應蛋白( CRP) 等］以及氣體信號分子［6］［如一氧化氮( NO) 、一氧化碳( CO) 及硫化氫( H2S) 等］等都參與了血管鈣化的發生發展過程。本課題組在前期動物實驗中亦發現，醛固酮、尾加壓素Ⅱ等可促進血管鈣化，而其他學者發現Intermedin、Fetuin-A 等活性因子可抑制血管鈣化，并且促進血管鈣化因子和抑制血管鈣化因子表達的失衡影響血管鈣化的進程［7-8］，因此探索新的參與血管鈣化的因子，不僅對于揭示血管鈣化的機制具有重要意義，而且對于防治血管鈣化可提供很好的實驗基礎。Apelin 是一種新的脂肪因子，具有心血管保護、抗肥胖和抗糖尿病等作用。研究發現Apelin /APJ 系統通過影響內皮功能、抑制動脈平滑肌細胞增殖及氧化應激等相關途徑參與動脈粥樣硬化的進程［9-10］，而血管鈣化與血管功能損傷直接相關如內皮損傷、動脈粥樣硬化等; 更進一步研究證實外源性Apelin 能夠抑制血管平滑肌細胞、主動脈瓣間質細胞等成骨樣分化，并發現平滑肌細胞表達APJ 受體蛋白，涉及 APJ/ERK1 /2 和 APJ/PI3K/Akt 等信號通路［11-12］。這些研究均提示 Apelin /APJ 系統與血管鈣化關系密切，目前尚未有體內外模型研究報告內源性Apelin /APJ 系統與血管鈣化之間的相關性。

本實驗采用大劑量維生素D3和尼古丁成功建立血管鈣化大鼠模型，結果顯示鈣化組血清和主動脈組織Apelin 的表達比正常組明顯減少，并且APJ 的表達亦同步下調，與鈣化程度呈負相關，提示Apelin /APJ系統可能是新的抑制血管鈣化因子，具體涉及的信號通路需進一步研究探討。

本實驗結果提示Apelin /APJ 系統不僅可抗動脈粥樣硬化，而且是一種內源性抗血管鈣化的活性因子，這將為血管鈣化的機制研究及防治提供新的思路，并提示Apelin /APJ 在防治心血管疾病方面具有潛在的廣闊前景。