酒鬼酒發酵車間空氣源細菌系統發育多樣性研究

吳秋蕾，黎有有，鄧麗穎，趙 湖，郝立娟，樊 林，陳義光，張 麗

（1.吉首大學生物資源與環境科學學院，湖南吉首 416000；2.酒鬼酒股份有限公司，湖南吉首 416000）

白酒是中國的傳統蒸餾酒，也是世界六大著名蒸餾酒之一。白酒的釀造原料多，工藝獨特，其濃郁的芳香和獨特的風味特征為其他蒸餾酒所不能及[1]。酒鬼酒是中國著名的白酒品牌之一，生產所在地湖南省吉首市地處云貴高原余脈武陵山區中心，是亞熱帶濕潤季風氣候，空氣濕潤，四季分明。酒鬼酒誕生于湘西這片神奇的土地上，在繼承湘西少數民族源遠流長民間工藝的基礎上，大膽創新，使得產品一問世，便以神秘而浪漫的個性文化形象被大眾認同，令人耳目一新[2]。酒鬼酒以其芳香秀雅、綿柔甘洌、醇厚細膩、后味怡暢、香味馥郁、酒體凈爽的獨特感官風格深受廣大消費者青睞[3]。

白酒微生物指白酒生產過程中以及生產環境中的微生物的總稱。人們對白酒微生物的研究主要集中在以下幾個方面：白酒微生物的分離、純化、鑒定和保藏；白酒微生物主要菌群(酵母、細菌、霉菌)的交替演繹規律的研究以及理化分析；優質功能菌的選育和應用；白酒生產環境中微生物的種類、數量的研究[4]。迄今為止，國內外對白酒微生物大部分領域的研究已較為成熟，而對白酒生產環境中微生物的研究較少。酒廠發酵車間空氣中的微生物是白酒微生物的重要來源[5]。本文采用空氣自然沉降法收集酒鬼酒發酵車間空氣源細菌（含放線菌），用純培養法分離純化，繼而用基于16SrRNA基因序列的系統發育分析法對分離菌株進行多樣性分析，以便較深入地了解酒鬼酒發酵車間空氣來源細菌多樣性的總體情況，為解開酒鬼酒獨特香型和特殊風味形成之謎題提供重要的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器設備和試劑

高壓滅菌鍋（mLS-3780，SANYO）；生物安全柜（BSC-04IIB2，蘇凈安泰）；恒溫培養箱（GNP-9050，上海精宏）；光學顯微鏡（Moticam 2306，Motic）；冷凍干燥儀（HETOLL1500，捷克）；離心機（Centrifuge-5427R，Eppendorf）；PCR擴增儀（PE-9600，BIO-RAD）；凝膠成像儀(GeneSnap 3.0，Syn-Gene)。細菌16SrRNA基因PCR擴增所用酶、引物和試劑購自生物工程上海有限公司（Sangon Biotech）。

1.2 培養基

共采用以下3種培養基為分離和純化培養基，均加制霉菌素100 mg/L抑制霉菌生長，加10%酒鬼酒酒醅浸汁配制[6]，倒平板用于分離，3種培養基配方如下。

營養瓊脂培養基(nutrient agar,NA)：牛肉膏粉3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，水1000 mL，pH 7.2～7.4。

麥芽膏-酵母膏培養基(ISP2)：酵母膏4.0 g，葡萄糖4.0 g，麥芽膏5.0 g，微量鹽溶液1 mL，蒸餾水1000 mL，瓊脂20 g，pH7.0～7.4。

高氏Ⅰ號培養基（Coates'mediumⅠagar）：Na-Cl 0.5 g，可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，FeSO40.01 g，MgSO40.244 g，瓊脂12 g，pH 7.2～7.4。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣區簡介和樣品采集

酒鬼酒股份有限公司發酵車間群位于湖南省吉首市“酒鬼酒地理生態功能保護區”的核心位置武吉鎮（28°08'～28°29'N，109°30'～110°04'E），共有8個發酵車間。本研究選取第五發酵車間為采樣區，選取發酵車間室內四角和中央區域距墻30 cm以外，高度距地面1 m左右無人員流動的范圍為采樣點，采用自然沉降法[7]收集空氣中微生物。預先制備好各種分離培養基平板，培養皿底編好序號，按預設順序和采樣計劃分放到各樣點，揭去皿蓋，暴露于空氣當中30 min。重新蓋好皿蓋，24 h內帶回實驗室。

1.3.2 菌株分離純化和形態觀察

采樣平板置于28℃恒溫培養箱中培養5 d后，隨機挑取單菌落進行4分離劃線純化，經過鏡檢純度后，使用牛奶管等多種形式保藏備用。根據菌落的顏色、大小、邊緣、濕潤度、透明度、與培養基結合程度等特征挑取培養皿上的單菌落進行四分體劃線純化，并做好相應菌落特征記錄。細胞形態用光學顯微鏡進行觀察，革蘭氏反應用革蘭氏染色法和KOH法進行[8-9]。

1.3.3 基于16SrRNA基因序列的系統發育分析

16SrRNA基因PCR擴增和序列測定使用一對細菌通用引物：正向引物Primer A（對應于E.coli的16S rDNA 5’端8-27f位 置）：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物Primer B（對應于E.coli16S rDNA 5’端152-1504r位置）：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。PCR擴增反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共25個循環；72℃后延10 min。16S rRNA基因PCR產物經純化后，用ABI PRISMTM 377XL DNA Sequencer全自動測序儀進行測序。

將測序得到的16SrRNA基因序列提交到Gen-Bank進行注冊并獲取相應的序列號。用National Center for Biotechnology Information網站(NCBI;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Ez Bio Cloud server(http://www.ezbiocloud.net/identify[10])所提供的Blast搜索程序(Basic Local Alignment Search Tool)，在GenBank/EMBL/DDBJ等公共數據庫中進行在線搜索高度相似序列，調取同源性高的相關典型菌株的16SrRNA基因序列組成序列集；運用CLUSTALX[11]軟件中的Alignment程序進行多重序列比對，根據Kimura模型[12]估算系統進化距離矩陣。采用MEGA 4.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)進行聚類分析和系統進化樹的構建[13]；以重復取樣1000次自展(bootstrap)法來評估系統發育樹的拓撲結構穩定性[14]。

1.3.4 生物學特征測定

菌株的表型特征、生理生化特性實驗按照《常見細菌鑒定手冊》[15]所用方法進行。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離

從不同培養基分離效果來看，NA培養基分離得到的菌落最多且形態相對來說較豐富，高氏Ⅰ號培養基上菌落形成單位相對較少且菌落形態單一。根據菌落的顏色、大小、邊緣、濕潤度、透明度、與培養基結合程度等特征，挑取培養皿上的單菌落進行四分體劃線純化4次，最終從本次采集的樣品中分離到127株純培養物。

2.2 類群多樣性

結合菌落形態、細胞顯微形態及部分生理生化實驗結果綜合分析，去除部分冗余菌株，最終從127個分離菌株中選取72株代表性菌株進行基于16S rRNA基因序列的系統發育多樣性分析。測定了各菌株的16SrRNA基因全長，并上傳GenBank公共數據庫，獲得了相應序列號（accession number，見表1）。在NCBI和EzBioCloud進行高度相關同源序列在線搜索和相似性計算，結果如表1所示。

從分析結果可以看出，72株代表性菌株屬于細菌域的4個門(phylum)(Actinobacteria,Deinococcus-Thermus,Firmicutes,Proteobacteria)、17個 科(Aurantimonadaceae,Bacillaceae,Bacillales Family XII,Corynebacteriaceae,Deinococcaceae,Intrasporangiaceae,Microbacteriaceae,Moraxellaceae,Nocardiaceae,Planococcaceae,Propionibacteriaceae,Pseudomonadaceae,Rhizobiaceae,Rhodobacteraceae,Sphingomonadaceae,Staphylococcaceae Xanthomonadaceae)、24個屬(Acinetobacter,Agrococcus,Arsenicicoccus,Arthrobacter,Aurantimonas,Bacillus,Corynebacterium,Deinococcus,Exiguobacterium,Janibacter,Kocuria,Luteococcus,Microbacterium,Micrococcus,Paracoccus,Pararhodobacter,Pseudomonas,Rhodococcus,Shinella,Sphingomonas,Sporosarcina,Staphylococcus,Virgibacillus,Xanthomonas)。多數菌屬于Actinobacteria門（34株，47.22%），其中Micrococcaceae為優勢科，含15株菌株；其次是Proteobacteria門（24株，33.33%）和Firmicutes門（11株，15.28%），還分離到3株屬于分類名稱尚未確定且目前根據《伯杰氏細菌手冊》暫稱為異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)的細菌。

2.3 物種與遺傳多樣性

按16SrRNA基因序列相似性小于97%的菌株屬于不同物種的歸類原則計[16]，分離自酒鬼酒發酵車間空氣樣品中的72株代表性菌株可以歸為53個物種（表1）。由表1可知，酒鬼酒發酵車間空氣樣品中可培養細菌具有較高的物種多樣性。除了4株（JSM 2215012、JSM 2215069、JSM 2215076、JSM 2215097）分別與其相關的有效發表已知物種的典型菌株的16SrRNA基因序列相似性為100%外，其他的分離菌株與其相關的已知物種的典型菌株的16S rRNA基因序列相似性在96.37%～99.88%之間，說明大部分分離菌株與其系統發育關系最密切的典型菌株之間存在較大的遺傳差異。

在這72株代表性菌株中，其中至少有5株（JSM 2215019、JSM 2215034、JSM 2215039、JSM 2215042和JSM 2215109）與其系統發育關系最為密切的已知物種的典型菌株的16SrRNA基因序列存在較大的差異，可能代表新的分類單元（potential new taxa）。基于這些菌株和與其系統發育關系最為密切的典型菌株的16SrRNA基因序列構建的系統進化樹見圖1。其中JSM 2215034和JSM 2215109的16SrRNA基因序列與已知物種的典型菌株差異較大，系統發育關系最近的典型菌株是Corynebacterium caseiLMG S-19264T和Deinococcus grandisDSM 3963T（圖1），它 們 之 間 的16S rRNA基因序列相似性分別為96.43%和96.37%，可能代表了Corynebacterium屬和Deinococcus屬的新物種。菌株JSM 2215019、JSM 2215039和JSM 2215042分別與Sphingomonas panniC52T、Arthrobacter agilisDSM 20550T和Paracoccus aestuariiB7T的系統發育關系最密切（圖1）。雖然這3株菌株與其系統發育關系最密切的典型菌株之間的16S rRNA基因序列相似性均高于97%（分別為97.24%、97.39%、97.25%），但是它們在表型特征上與各自相關的典型菌株卻存在一定的差異，且它們在系統進化樹上各自形成了獨立亞分支，可能分別代表Sphingomonas，Arthrobacter，Paracoccus屬的3個潛在新種（potential novel species）。

然而最終確定這些菌株的分類地位，還需要綜合分析其形態特征、細胞化學特征、生理生化特征以及與其相對應的相關典型菌株基因組間的DNA-DNA同源性分析等多相分類(polyphasic taxonomy)研究結果才可下定論，這些多相分類工作正在進行中，這些菌株部分生理生化特征見表2。

3 討論

本研究采用純培養法和基于16SrRNA基因序列的系統發育分析對分離自酒鬼酒發酵車間空氣樣品中的可培養細菌的多樣性進行了研究。用于系統發育分析的72株菌分別歸屬于細菌域的4個門、17個科、24個屬。按16SrRNA基因序列相似性大于97%的菌株屬于同一物種的歸類原則計，這72株代表性菌株可以歸為53個物種。大部分的分離菌株與其系統發育關系最密切的已知物種典型菌株之間的16SrRNA基因序列都具有較大的遺傳差異，除了4株(JSM 2215012、JSM 2215069、JSM 2215076、JSM 2215097)分別與其相關的有效發表已知物種的典型菌株的16SrRNA基因序列相似性為100%外，其他的分離菌株與其相關的已知物種的典型菌株的16S rRNA基因序列相似性在96.37%～99.88%之間，其中有5株(JSM 2215019、JSM 2215034、JSM 2215039、JSM 2215042和JSM 2215109)菌株分別代表Sphingomonas,Corynebacterium,Arthrobacter,Paracoccus和Deinococcus屬的潛在新種。這些結果均表明了酒鬼酒發酵車間空氣樣品中存在較高的類群多樣性。

表1 分離菌株與其系統發育關系最密切的典型菌株間的發育關系

圖1 基于16SrRNA基因序列構建的5個代表潛在新類群菌株的系統發育樹

表2 潛在新類群代表5菌株的部分生理生化特征

據相關文獻報道，白酒生產過程中發酵后釀造微生物細菌優勢菌為芽孢桿菌屬[17-20]，而本研究的72株分離自酒鬼酒發酵車間空氣樣品中可培養細菌代表性菌株中也存在一定數量的革蘭氏陽性產芽孢菌（6株，其中Bacillaceae科5株，Bacillales Family XII科1株），但本研究成果表明發酵車間空氣樣品可培養細菌中優勢菌為非芽孢菌（66株；91.67%），其中占優勢的是34株放線菌門（Actinobacteria）和24株變形菌門（Proteobacteria）菌株（表1）。其中異常球菌-棲熱菌門包括一些能抵抗高劑量輻射、耐熱等在各種嚴酷逆境環境中生存的球狀細菌，它們有著極強的生存能力[21]。而在酒鬼酒發酵車間空氣分離到的這3株異常球菌-棲熱菌門菌株，是否表明酒鬼酒發酵過程中高溫產酒環境微生物主要來源于發酵車間空氣中的微生物，是否對酒鬼酒發酵過程中高溫產酒環境耐熱機制起到一定的作用，探究其適應高溫環境的耐熱機理，分布規律與來源等課題值得深入研究。