蜂蜜酒對腸道微生物和腸黏膜免疫功能的影響

楊曉婷，陳 濤，楊曉滿，趙可及，陸筑鳳，李加友

（1.嘉興學院生物與化學工程學院，浙江嘉興 314001；2.宿遷市產品質量監督檢驗所，江蘇宿遷 223800）

蜂蜜是蜜蜂從開花植物的花中采得的花蜜，在蜂巢中釀制而成。《神農本草經》把“石蜜、蜂子、蜜蠟”列為上品，指出其有“除百病、和百藥”的作用，且“多服久服不傷人”[1]，可見蜂蜜的保健功能很早就被認識到。隨著蜂蜜產業的發展，高附加值蜂蜜產品的開發成為一種趨勢。蜂蜜酒是以蜂蜜加水稀釋后經特殊工藝生產的發酵酒，含有多種人體必需的氨基酸、礦物質和維生素，有極高的營養價值；酒精含量在10%vol～14%vol，不含甲醇和甲醛[2]；口感獨特，備受消費者的青睞。因此，評估蜂蜜酒的生物學功效，并與其他市售同類產品進行比較，為蜂蜜酒的深入開發奠定基礎。

腸道微環境主要包括4種屏障：微生物形成的生物屏障、腸黏膜免疫屏障、消化液及抑菌物質等形成的化學屏障和上皮與細胞形成的機械屏障[3]。本文主要研究生物屏障和腸黏膜免疫屏障，腸道表面定殖著大量的微生物，它們共同參與腸道吸收、免疫調節等過程，共同維持腸道的健康與平衡。腸黏膜堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）是腸道吸收消化的標志性酶類物質，與腸道微生物的組成和豐度存在密切關系，當腸道中革蘭氏陰性菌多時，腸堿性磷酸酶活性增高，說明腸道中潛在的致病菌多[4]。此外腸黏膜免疫屏障中分泌型免疫球蛋白SIgA也會參與腸道免疫調節，抵御病原菌的侵害，防止腸道炎癥的產生，分泌型免疫球蛋白SIgA含量越高，說明腸黏膜免疫屏障越強[5]。

目前關于酒精飲品生物學效應的評價很多，大部分從肝功能著手，探究酒類物質對肝臟乙醇脫氫酶、胸腺指數、脾臟指數的影響[6-7]，而近些年發現腸道和宿主健康存在密切的聯系[8-9]，因此使用腸道相關指標來評價蜂蜜酒對健康的影響非常重要，本文擬就蜂蜜酒對小鼠生長、腸道微生物和宿主免疫因子的影響進行研究，進而初步揭示蜂蜜酒對人體腸道健康的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗小鼠：以4周齡的雌性昆明小鼠為試驗對象，隨機分成4組，每組5只重復，分別命名為純凈水組、酒精組、蜂蜜水組、蜂蜜酒組，其中酒精組為陰性對照。設置處理小鼠的酒精最終濃度是0.11%vol，該濃度對小鼠生理活動沒有任何影響，將試驗材料加入至小鼠飲用水中正常喂養，處理30 d，每只小鼠飲水量為9～12 mL/d。

試劑及耗材：陰性對照為食用酒精（酒精度55%vol）。蜂蜜水是將市售蜂蜜（糖度40°Bx）原液與水按1∶4稀釋而成，蜂蜜來源于浙江省嘉興市平湖養蜂場，主要成分為總糖（葡萄糖和果糖）80%，水15%，還有蛋白質、礦物質、果膠、維生素等；蜂蜜酒是以上述配制的蜂蜜水為原材料，加入安琪酵母發酵而得，酒精濃度為14%vol，主要成分為酒精14%vol、總氨基酸1.5 g/L、礦物質1.1 g/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 食物轉化率計算

1.2.2 肝臟切片觀察

將喂養30 d的小鼠解剖，取肝臟組織用10%中性甲醛固定，完成后進行梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片，進行HE染色后用中性樹脂膠封片，用光學顯微鏡觀察肝臟組織結構。

1.2.3 腸道微生物活菌計數

將喂養30 d的小鼠糞便收集后于厭氧箱中直接進行10倍系列稀釋，選擇運用不同的培養基對大腸桿菌（Escherichia coli）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）、乳酸桿菌（Lactobacillus）進行活菌計數，選擇培養基平板分別為麥康凱培養基、BBL培養基和MRS瓊脂培養基，其中雙歧桿菌和乳酸桿菌使用完全厭氧培養。

1.2.4 堿性磷酸酶活性測定

小鼠喂養30 d后斷頸，解剖得小腸組織，取小腸前1/3段，用0.9%生理鹽水洗掉殘渣，用細胞刮刀刮取小腸黏液于1.8 mL無菌生理鹽水中，稱重，并加入2顆鋼珠勻漿，3000 r/min離心20 min，收集上清液，速凍分裝保存。將所取的小腸黏液層上清液從-80℃取出置于冰上至融化，考馬斯亮藍法測定黏液層上清液中的總蛋白。同時將上清液稀釋10倍后，用堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物工程有限公司）檢測，通過計算每克蛋白與酚反應的金氏單位來定量堿性磷酸酶活性。

1.2.5 腸黏膜SIgA含量測定

將上述所取的小腸黏液層上清液從-80℃取出置于冰上至融化，按照分泌型免疫球蛋白SIgA酶聯免疫試劑盒說明書進行檢測，試劑盒來源于南京建成生物工程有限公司。

1.2.6 數據處理

數據處理采用GraphPad統計軟件，采用非配對t檢驗進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 蜂蜜酒對肝臟的影響（圖1）

圖1 不同處理組小鼠肝臟切片的顯微對比

長期過量飲酒會對肝臟造成損傷，通過對喂養30 d后小鼠的肝臟進行對比，發現蜂蜜水組、蜂蜜酒組的小鼠肝臟顏色鮮紅，柔軟有彈性，而陰性對照（酒精組）的小鼠肝臟顏色偏黃，有稍微的硬化。切片觀察發現（圖1），酒精組肝臟胞腔中出現大小不等的空泡，邊界清晰，屬于肝細胞脂肪變性，而其他處理組的肝臟細胞排列均勻，細胞核明顯，細胞與細胞間界限清晰，說明蜂蜜酒對小鼠肝臟沒有明顯的影響。

2.2 蜂蜜酒對食物轉化率的影響（圖2）

圖2 不同處理對小鼠食物轉化率的影響

為探究不同處理組對小鼠生長的影響，每5天記錄其飲食量和生長情況。試驗發現，陰性對照組（酒精組）的小鼠食物轉化率明顯低于純凈水組，在第5天時兩者相差11.9%；而蜂蜜水組和蜂蜜酒組的小鼠食物轉化率明顯高于純凈水組，在第5天時差異最明顯。說明酒精會降低小鼠的食物轉化率，影響其正常生長；而蜂蜜水和蜂蜜酒會增加食物轉化率以促進生長，可能是因為蜂蜜水和蜂蜜酒中均含有一定量的營養物質和其他生物活性物質，可以抵抗酒精對食物消化的負面作用。

2.3 蜂蜜酒對腸道微生物生長的影響（圖3）

圖3 不同處理對小鼠腸道微生物生長的影響

為比較各種處理對小鼠腸道微生物的作用，通過活菌計數的方法檢測糞便中大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌的含量，實驗發現，酒精組小鼠糞便中大腸桿菌的含量（圖3A）顯著升高（p＜0.05），而蜂蜜酒組大腸桿菌含量顯著下降（p＜0.05），說明蜂蜜酒對腸道潛在致病菌（大腸桿菌）有顯著的抑制作用。酒精組（圖3B）小鼠糞便中雙歧桿菌含量顯著降低（p＜0.05），蜂蜜水組和蜂蜜酒組處理后雙歧桿菌含量極顯著升高（p＜0.01），說明蜂蜜水和蜂蜜酒都能促進腸道中雙歧桿菌的生長。就腸道中乳酸桿菌的變化而言（圖3C），酒精組的乳酸桿菌生長受到極顯著抑制（p＜0.01），而蜂蜜酒組的乳酸桿菌和純凈水組比較，沒有顯著的影響（p＞0.05），說明蜂蜜酒對乳酸桿菌的含量沒有顯著影響。因此研究結果表明，蜂蜜酒有改善腸道微生物的作用。

2.4 蜂蜜酒對腸堿性磷酸酶活性的影響（圖4）

圖4 不同處理對堿性磷酸酶活性的影響

為探究各種處理對小鼠腸堿性磷酸酶含量的影響，實驗處理后取各組小鼠腸黏膜進行檢測，發現（圖4）酒精組小鼠腸堿性磷酸酶活性顯著上升（p＜0.05），蜂蜜水組腸堿性磷酸酶活性沒有顯著變化（p＞0.05），而蜂蜜酒處理小鼠30 d后，AKP活性顯著性降低（p＜0.05）。堿性磷酸酶是腸道消化吸收的關鍵酶，其活性與腸道病原菌的含量密切相關，當其含量降低時，說明腸道中病原菌受到抑制，炎癥產生概率小。因此飲用蜂蜜酒對腸道病原菌有一定的抑制作用。

2.5 蜂蜜酒對腸黏膜SIgA含量的影響（圖5）

圖5 不同處理對腸黏膜SIgA含量的影響

腸黏膜免疫球蛋白SIgA是腸道黏膜屏障的主要效應因子，其含量升高說明腸黏膜的穩定性、免疫能力增強，抑制腸道炎癥和感染的發生[11]，相反則說明腸黏膜免疫處于抑制狀態，有損腸道健康。試驗發現，酒精組小鼠腸道SIgA含量顯著下降（p＜0.05），小鼠腸黏膜免疫力低下；而蜂蜜酒組腸黏膜SIgA有顯著提升（p＜0.05），說明飲用蜂蜜酒能增強腸道免疫能力，抑制腸炎的產生，保護腸道。相比較而言，蜂蜜水對腸黏膜SIgA的促進作用弱于蜂蜜酒，說明蜂蜜水經發酵后的產物——蜂蜜酒對宿主的保健能力更強。

3 討論

本實驗通過動物試驗評估了蜂蜜酒對小鼠生理、腸道健康的影響，試驗發現，長期飲用蜂蜜酒對肝臟沒有顯著的負面影響，同時還能提高小鼠的食物利用率，促進生長，提高免疫機能，具體原因可能包括以下幾點：

（1）研究表明，低劑量的酒精會增強腸道通透性[12]，促進營養物質的消化吸收；但是，相同酒精濃度的酒精組的食物利用率卻很低，說明酒精對小鼠生長具有其他負作用，導致小鼠食物利用率低，而蜂蜜中含有抵抗酒精負面作用的生物學活性成分。

（2）蜂蜜水經過釀造加工而成的蜂蜜酒保留了原有的益生成分[13]，如氨基酸、礦物質和維生素等，這些益生成分對腸道微生物具有改善作用，促進有益菌生長的同時抑制潛在致病菌。有益菌乳酸桿菌和雙歧桿菌在免疫調節、降低血液中膽固醇、產生代謝物抑制有害菌的侵染方面具有重要作用[14]，而腸道中潛在致病菌大腸桿菌含量較高時會引起腸道炎癥的產生，導致腹瀉[15]。腸道微生物的組成和相對豐度直接與腸道的消化吸收、免疫調節密切相關[16]。因此，蜂蜜酒可以通過改善腸道微生物的組成促進食物的消化吸收，增加食物利用率，促進生長。

（3）飲用蜂蜜酒增強腸道生物屏障和腸黏膜免疫功能。

其一，腸道微生物形成的生物屏障影響腸堿性磷酸酶的活性[17]，而腸堿性磷酸酶參與腸道的消化吸收和免疫平衡的調節。正常菌群中存在大量的革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、變形桿菌等，這些陰性菌表面的脂多糖在腸道中的濃度也相對較高，當其進入血液循環時會誘導機體產生炎癥，甚至休克，而腸黏膜堿性磷酸酶會催化脂多糖去磷酸化，間接抑制炎癥反應的發生[18]，陰性菌含量越低，堿性磷酸酶活性越低，腸免疫能力越強[19]。研究結果表明，蜂蜜酒處理小鼠后，大腸桿菌的含量顯著降低（p＜0.05），與此同時腸黏膜堿性磷酸酶的活性顯著下降（p＜0.05），該結果與前人研究結果一致，說明蜂蜜酒對腸道具有保護作用。

其二，腸黏膜SIgA是腸道黏膜屏障的主要效應因子，由漿細胞分泌產生，參與形成腸黏膜的穩定性、防止腸道感染的發生[20]。陳麗梅等[21]研究發現枯草芽孢桿菌YK-1R飼養斷奶仔豬，能增加菌群多樣性及提高SIgA的分泌，增強腸道免疫能力，促進生長。賈玉臣等[22]用瑞士乳酸桿菌灌胃小鼠，腸黏膜SIgA含量顯著升高，腸道免疫能力明顯增強，說明SIgA顯著增高能提高腸道免疫功能，促進腸道消化吸收，提高食物轉化率。同時此前相關研究也證明SIgA的分泌與腸道微生物之間也存在密切的關系[23]。腸道益生菌的定殖促進了SIgA的分泌，而SIgA的分泌同時也會促進益生菌的定殖，兩者相互作用，共同維持腸道健康，促進生長。本文試驗結果也表明，蜂蜜酒能顯著改善腸道微生物的相對豐度，促進有益菌雙歧桿菌、抑制潛在致病菌大腸桿菌的生長，同時蜂蜜酒處理組的腸黏膜免疫球蛋白SIgA的含量也顯著增加（p＜0.05），與前人研究結果一致。因此蜂蜜酒可以通過提高腸道免疫功能，抵御病原菌入侵，促進宿主健康。

綜上所述，蜂蜜酒可以通過改善腸道微生物和腸黏膜免疫來促進宿主健康，與蜂蜜水相比而言對腸道保健效果更明顯。目前通過改善飲食來調理腸道微生物成為當下維持健康生活狀態的首選方式[24-25]，我們的研究工作為蜂蜜產業的深度開發和蜂蜜酒的生產奠定理論基礎。