氨基糖苷類抗生素的拓展應用研究進展

盧明 陳代杰

(1 中國醫藥工業研究總院，上海 201203；2 上海交通大學藥學院，上海 200240)

氨基糖苷類抗生素是較早被發現并應用于臨床的一類抗生素。自1944年Waksman從灰色鏈霉菌中分離得到鏈霉素，大量氨基糖苷類抗生素相繼被發現并應用于細菌性感染的臨床治療[1]。鏈霉素發現近20年后，研究表明氨基糖苷類抗生素能夠抑制提前終止密碼子PTC(premature termination codon)的閱讀并恢復大腸埃希菌中的全長蛋白質產生[2]。在人體中5%～70%的遺傳疾病是由框內無義突變引起的，其在致病基因內引入提前終止密碼子(PTC)。因此，在翻譯過程中形成了具有病理學意義的無功能或功能缺陷的截短蛋白。PTC抑制可以描述為一種以基因和疾病非依賴性方式治療突變的治療策略，該方法旨在抑制蛋白質合成過程中核糖體的保真度，以便可以將共享PTC 3個核苷酸中2個核苷酸的近同源氨基tRNA插入肽鏈，從而繼續翻譯，并完整翻譯等長度的功能蛋白[3]。因此，對許多遺傳性疾病的治療，抑制PTCs是一種可行的策略。

隨著RNA催化潛力的發現，許多氨基糖苷被報道與各種RNA分子相互作用并干擾其功能。其中除了原核蛋白翻譯抑制位點16S rRNA，還包括第一組內含子自我剪接酶、RNase P和錘頭狀核酶[4]。此外，這些抗生素還通過干擾必要的RNA蛋白接觸抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)的復制[5-6]。在過去的幾年里，關于RNA結構和功能的信息迅速增加，對RNA結合抗生素的作用模式有了更詳細的了解。本文將從氨基糖苷類抗生素作用機制及應用兩方面綜述其拓展研究進展。

1 氨基糖苷類抗生素作用機制

1.1 氨基糖苷類抗生素抑制PTCs的作用機制

氨基糖苷類抗生素是一類由單個或多個糖基取代的氨基環醇類化合物。其殺菌作用是通過與原核生物30S核糖體16S rRNA的A1408部位結合，導致蛋白質錯譯，從而促使細菌細胞的死亡[7]。在真核生物的翻譯過程中(圖1)，同源氨基酰基-tRNA(完全匹配的堿基對)和近同源氨基酰基-tRNA(包含3個堿基對中的2個)都可以與A位點相互作用。同源氨基酰基- tRNA進入A位點后，氨基酸添加到多肽鏈上后易位到P位點，空出A位點，從而允許下一個密碼子信使RNA序列的堿基配對和翻譯[8]。當一個核糖體遇到一個終止密碼子的信使RNA序列，沒有同源氨基酰基-tRNA可以與A位點序列堿基配對。此時，真核釋放因子eRF1和eRF3通過二者之間的相互作用促進肽- trna的水解，并通過形成“終止復合物”來釋放新形成的多肽。eRF1識別并結合A位點的終止密碼子，改變了核糖體肽轉移酶的活性。eRF3以依賴于GTP的方式通過eRF1刺激肽的釋放[9-10]。

近同源的氨基酰基-tRNA能夠與eRFs競爭A位點上的終止密碼子的結合[11]。這導致相應的氨基酸被整合到延長的多肽鏈中，并將這種tRNA-肽鏈復合物轉移到P位點，有效地允許終止密碼子的“通讀”。每個終止密碼子都可以通過使用一組特定的近同源氨基酸進行無義抑制來翻譯(圖1)。正常情況下，人體內PTCs的通讀概率＜1%，自然終止密碼子的抑制概率＜0.1%[12]。無義突變的基礎水平過低，無法恢復功能，但功能蛋白的進一步增加可能緩解疾病[13]。多種氨基糖苷類藥物在體內外及多種組織和疾病模型中均已表現出無義抑制活性，包括慶大霉素、帕洛霉素、G418、鏈霉素、利維霉素、妥布霉素等，通過增加PTCs通讀恢復少量的功能活性蛋白，在緩解多種遺傳疾病方面具有廣闊的臨床應用前景[14-17]。在氨基糖苷介導的無義抑制過程中，通讀效率與誘導A位點結構變化之間的關系尚不完全清楚。目前上述氨基糖苷類抗生素中，G418、慶大霉素和帕洛霉素具有最廣泛和最有效的PTC通讀活性[19-21]。PTCs通讀效能不僅因基因而異，還取決于相關基因中終止密碼子的類型和位置以及周圍的mRNA序列。一些終止密碼子比其他密碼子更容易被通讀，盡管有一項研究表明終止密碼子的類型和慶大霉素治療效果之間沒有相關性，但對于UGA＞UAG＞UAA的偏愛確已被報道[11,22]。

1.2 氨基糖苷類抗生素抑制RNA酶作用機制

氨基糖苷類抗生素由氨基糖與氨基環醇通過氧橋連接而成，是具有高度柔韌性的多電荷化合物。RNA鏈上的負電荷與氨基糖苷上的正電荷結合，從而有助于將其容納在RNA螺旋內部環內的結合袋中或核酶核心中，以進行特定的接觸。研究發現，核酶中存在兩種類型的氨基糖苷結合位點：第一種由不對稱內部環組成，如HIV的RRE和Tar結構域中的解碼位點[23-24]。第二種結合位點是核酶催化核心中的金屬離子結合口袋[25]。在I型結合位點時，作用方式可能是通過RNA結構的輕微扭曲和干擾功能性底物的結合而實現的，而在II型結合位點中，氨基糖苷類則通過置換必要的二價金屬離子起作用。核糖核酸酶P(核糖核酸酶P)是一種依賴Mg2+的核糖核酸內切酶，負責tRNA前體5'端加工。在Mikkelsen等[26]研究發現RNase P在有或無RNase P蛋白時均可被幾種氨基糖苷類抑制。

在過去的幾十年中，氨基糖苷類抗生素對抗HIV-1的功效已經被廣泛證明。HIV-1基因表達是由Tat激活的，Tat是一種病毒編碼的轉錄激活蛋白，它與一種稱為TAR的病毒RNA序列相互作用，位于所有病毒mRNA的5-末端。Lapidot等[27]基于HIV-1 RNA結合的肽模型，基于Tat反應元件-配體復合物和氨基糖苷- RNA相互作用的NMR結構，以及HIV-1 Tat結構，設計合成了氨基糖苷-精氨酸偶聯物(AACs)和氨基糖苷多精氨酸偶聯物(APACs)作為Tat的模擬物，這些化合物通過與HIV-1 Tat反應元件(TAR)RNA和HIV-1 Rev反應元件(RRE)RNA相互作用調節RNA參與病毒生命周期的各個階段。除了作為Tat拮抗劑，它們還可以通過阻斷HIV-1細胞進入的幾個步驟來抑制HIV-1的感染性。AACs和APACs通過在cd4結合位點與gp120相互作用，通過在CXCR4 mAb 12G5結合位點與CXCR4相互作用，以及通過與gp41外區瞬時結構相互作用抑制HIV-1細胞的進入(圖1)[27-30]。

2 氨基糖苷類抗生素的拓展應用

2.1 氨基糖苷類抗生素抑制PTCs的應用研究

圖1 蛋白質翻譯和氨基糖類抗生素(AGs)作為無義抑制劑的作用機制Fig.1 The mechanism of protein translation and aminoglycoside antibiotics as nonsense inhibitors

框內無義突變引起的遺傳性疾病，主要包括囊性纖維化(CF)[31]，Duchenne肌營養不良癥(DMD)[32]，Usher綜合癥(USH)[33]以及Hurler綜合征(HS)，其分別涉及CFTR、dystrophin、PCDH15和IDUA蛋白基因的突變，導致翻譯過早終止并最終形成錯誤截短的非功能性蛋白質(表1)。氨基糖苷類抗生素能夠抑制提前終止密碼子PTC的閱讀并恢復全長蛋白質的翻譯。

目前國外主要用于慢性銅綠假單胞菌肺部感染的囊性纖維化患者和非CF性慢性支氣管擴張患者的藥物有妥布霉素吸入溶液(國外已批準上市)、阿米卡星注射液和慶大霉素注射液。Du等[32]研究發現慶大霉素可以部分恢復DMD和CF[31]小鼠模型中功能蛋白的表達。CFTR蛋白的合成從正常水平的＜1%增加至5%，這可能會大大降低CF疾病的嚴重性[34-35]。2017年2月13日，FDA批準了Vertex醫藥公司的Symdeko(tezacaftor/ivacaftor+ivacaftor)上市，用于治療12歲及以上的囊性纖維化患者。這也是Vertex獲得FDA批準的第3種針對囊性纖維化根本病因的治療藥物。Duchenne肌營養不良癥發病機制主要為編碼抗肌萎縮蛋白(dystrophin)基因DMD的無義突變過早地停止了抗肌萎縮蛋白的翻譯，由此導致的紊亂使得蛋白質不能全部表達而不再起作用。Translana(Ataluren或PTC-124，CFTR-G542X 無義等位基因抑制劑)是歐洲藥品管理局(EMA)于2014年7月31日批準的蛋白表達修復新藥，靶向致病基因編碼蛋白，通過促進核糖體通讀來治療，允許繞過致病變異體并繼續翻譯過程以產生功能性蛋白質[36]。

表1 氨基糖苷類抗生素的應用Tab.1 Application of aminoglycoside antibiotics

自1957年Schuknecht[37]首先提出氨基糖苷類抗生素治療梅尼埃病并逐漸用于臨床，其治療效果也逐漸得到肯定。雙盲隨機對照的前瞻性研究以及循證醫學研究均已經證實了鼓室注射慶大霉素對梅尼埃病患者眩暈控制的有效性[38]。Watson等[39]分析認為鼓室內注射低劑量的慶大霉素治療對控制梅尼埃病患者的癥狀有效，同時可以保留聽力。Pullens等研究發現，在雙盲、安慰劑對照的關于鼓室內慶大霉素對眩暈癥狀影響的隨機臨床試驗中，與安慰劑組相比，這兩項試驗均發現慶大霉素組的眩暈癥狀明顯減少。鼓室注射慶大霉素(ITG)可能是根除梅尼埃病患者眩暈最有效的非手術治療，但也是具有不可忽視的聽力損失風險的破壞性治療方法。ICON推薦對側前庭功能良好的患者在聽力受損時優先使用ITG作為破壞性治療方法[40]。

Usher綜合征是一種常染色體隱性遺傳病，患者先天性、雙側性耳聾，伴有視網膜色素變性(RP)引起的視力損害。迄今已經鑒定出14個與user綜合征相關的致病基因，包括MYO7A、USH1C、USH1G、CDH23和PCDH15等。29%～50%的USH1型是由MYO7A表達不正常引起的。該基因含有49個外顯子，編碼2215個氨基酸。c.4513G＞ T (p.Glu1505Ter)突變會導致蛋白質截短，激活無義介導的衰敗(NMD)途徑。目前已經開始使用TranslarnaTM(也稱為ataluren或PTC124)進行無虹膜的試驗(NCT02647359)。同樣，賀勒氏癥主要由編碼α-L-艾杜糖醛縮酶(IDUA)的基因突變導致的，酶替代療法(ERT)目前正在使用或正在測試中。Aldurazyme是首個用于治療包括Hurler綜合征在內的黏多糖貯積癥I(MPS-I)的生物制劑。Wang等[41]利用重組腺病毒相關載體，通過Cas9/sgRNA系統進行基因編輯。

盡管氨基糖苷類抗生素已顯示出對PTCs抑制治療應用具有相當大的潛力，但實際應用過程中仍然存在一些問題。氨基糖苷類(如慶大霉素)不易溶于脂質，全身給藥時難以穿透細胞[42]。最值得注意的是，這些藥物仍難以穿過血視網膜或血腦屏障，有效全身性輸送至視網膜或腦脊液的挑戰仍然存在。目前已經在嘗試利用脂質體包囊氨基糖苷以實現細胞內遞送，以期通過增加藥物向細胞質的遞送來優化治療效果[43]。2009年，Nudelman等[19]報道了與慶大霉素相比，新型氨基糖苷類衍生物(NB54)的開發具有更好的通讀效率和更低的毒性。該化合物在體外模擬針對具有引起疾病的無義突變的基因的DNA片段進行測試。NB54表現出針對DMD、HS以及CF等病癥有關的基因的增強的PTC抑制能力。Nudelman等的研究基于優化藥物潛在的抑制功效和毒性，為開發氨基糖苷的新型結構提供了新的方向。而在這個方向上的進一步發展可能為治療由無義突變引起的許多遺傳疾病提供更多的可能性。

2.2 氨基糖苷類抗生素抑制RNA酶的應用研究

除了干擾遺傳密碼的翻譯外，氨基糖苷類抗生素在體外還能抑制幾種核酶的活性。第一組內含子自剪接[44]、錘頭狀核酶自剪接[45]、人類肝炎病毒(HDV)核糖酶[46]、發夾狀核酶Mg2+誘導的自我剪接[47]以及RNase P RNA的tRNA加工活性[48]都可被相同的氨基糖苷類抑制，最顯著的是新霉素B和妥布霉素。關于錘頭狀核酶的抑制，研究發現新霉素B至少與一個Mg2+競爭，且抑制效率依賴于pH值，即與抗生素的質子化氨基相關[49]。在沒有金屬離子的情況下，氨基糖苷類抗生素還可以促進發夾狀核酶的裂解反應。發夾狀核酶不依賴于二價金屬離子進行催化，但Mg2+會極大地促進其折疊。新霉素B可以替代折疊所需的Mg2+，因此可以強烈刺激核酶的活性[47,50]。這與新霉素B對錘頭狀核酶的作用相反，后者通過從催化核心置換必需的Mg2+而被抗生素抑制。但Chia等[51]也發現HDV的核酶在體內對氨基糖苷不敏感，盡管該核酶在體外是敏感的。

2018年11月，雷鳴團隊成功解析了酵母內源RNase P全酶及其與底物pre-tRNA的復合物結構，他們發現RNase P以一種“雙錨定(double anchor)”的機制來識別tRNA前體。tRNA的5'端被特異的錨定在催化中心以促使其完成切割反應。底物tRNA的結合誘導了該酶催化中心一個關鍵殘基的巨大的構象變化。結合分子動力學模擬，他們提出了RNase P催化反應的雙鎂離子模型[52]。新霉素B的結合會干擾二價金屬離子進入RNA。綜上可知，氨基糖苷與Mg2+離子競爭重要的二價金屬離子結合位點。因此，RNase P作為一種重要的酶，是一種潛在的藥物靶點，可作為多種氨基糖苷類先導化合物開發新藥。

Lapidot等[27]基于HIV-1 RNA結合的肽模型，設計合成了氨基糖苷-精氨酸偶聯物(AACs)和氨基糖苷多精氨酸偶聯物(APACs)作為Tat的模擬物。這些化合物分子靶向HIV-1 TAR或RRE，在較低的微摩爾范圍內以50%的有效濃度抑制HIV-1的病毒復制，最有效的化合物是六精氨酸-新霉素B和九烷基-精氨酸-新霉素偶聯物。它們除了充當Tat拮抗劑外，還通過阻止HIV-1細胞進入的幾個步驟來抑制HIV-1感染性。用同一種化合物針對病毒生命周期中的幾個關鍵過程不僅可能提高其抗病毒功效，更重要的是，可能降低病毒對該化合物產生耐藥性的能力。因此，AACs和APACs可能成為開發多靶點新型HIV-1抑制劑的先導化合物。

目前，人們已經通過不同的方法，包括組合合成、高通量篩選和對現有氨基糖苷類藥物的化學修飾等，來解決分離對獨特RNA基序特異性增強和對細胞毒性降低的新藥物的障礙[53-54]。通過化學修飾增加氨基糖苷的電荷和降低它們的堿度，可以增加它們對目標RNA的親和力[55]。氨基糖苷的二聚體也可以增強對錘頭狀核酶的結合親和力[56]。所有這些新技術最終將有助于更好地理解抗生素與靶標之間的相互作用，從而在已有抗生素的基礎上開發出更高效低毒的抗生素。