2-脫氧鏈霉胺取代衍生物的結構確證和1H核磁定量

王海東 蘇曉春 代博娜 倪瑤 李紅杰 錢秀萍,*

(1 常州方圓制藥有限公司，常州 213125；2 上海交通大學分析測試中心，上海 200240；3 上海交通大學藥學院，上海 200240)

抗菌藥物一直被作為臨床感染性疾病治療的重要手段，但由于抗菌藥物合理使用問題的日益突出，耐藥菌株引起的感染是感染性疾病高病死率的主要原因[1]。新型氨基糖苷類抗生素如巴龍霉素(paromomycin)、西索米星(sisomicin)、依替米星(etimicin)、奈替米星(netilmicin)、阿米卡星(amikacin)、阿貝卡星(arbekacin)、妥布霉素(tobramycin)等對耐藥菌感染具有積極的治療作用[2-4]。在阿米卡星合成和工藝改進中有兩個重要的中間體化合物1和化合物2需要進行結構確證和定量分析，然而化合物1和化合物2無紫外吸收，且無商品化的標準品。氨基糖苷類抗生素的含量檢測有HPLC、熒光法、離子色譜法、流動注射化學發光法等[5]。常用的高效液相色譜法(HPLC)需要對樣品進行衍生化處理或采用聯用技術等復雜操作，商品化標準品的缺乏更給定量分析帶來了困難[6]。氫核磁振定量分析(quantitative nuclear magnetic resonance,qNMR)集物質鑒別和含量測定于一體已應用于新藥研發、對照品研究和質量控制等藥學領域[7-9]，使用單一參照化合物即可定量多個組分，而且比值定量測定不需要強度校正，精確度和精密度好，因此對藥物研發過程中的混合物及含雜質樣品的定量分析具有獨特的優勢[9]。本論文采用13C NMR、1H NMR、1H1H-COSY、HMBC和MS對化合物1和化合物2進行了結構確證，并應用1H NMR內標法測定了其量，為阿貝米卡星的工藝改進提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Bruker AvanceⅢ 600MHz超導核磁共振波譜儀(瑞士，Bruker Biospin公司)；島津-LC-20AT HPLC色譜儀(日本，島津)；Mettler Toledo XP6電子天平(瑞士，Mettler Toledo公司)；賽默飛ThermoScientific LTQ orbitrap XL高分辨液質聯用儀。

重水(D2O，規格0.5mL，99.9% atom% D)購自Cambridge Isocope Laboratories；馬來酸(TraceSure?)購自WAKO和光純藥工業株式會社；甲酸鈉(純度99.998%)、冰乙酸(HPLC級)、無水硫酸鈉(HPLC級)購自Aladdin；硫代乙醇酸(HPLC級)、鄰苯二甲醛(HPLC級)、戊烷磺酸鈉(HPLC級)購自TCI；乙醇(HPLC級)購自TEDIA；甲醇(HPLC級)購自Merck；氫氧化鈉(藥檢專用)購自沃凱；硼酸(GR級)購自國藥集團化學試劑；水為高純水?；衔?和化合物2由常州方圓制藥有限公司合成。

1.2 1H NMR定量測定

供試溶液配制：準確稱量化合物1和化合物2約4～22mg、內標物馬來酸和甲酸鈉約6.5mg于2mL EP管中，加入D2O 0.6mL，超聲(35kHz)10min使其完全溶解，再轉移適量至5mm的核磁管中備用。

儀器參數設置：采用zg30脈沖序列在恒溫(25℃)下獲取1H NMR譜。具體實驗參數：譜寬(SWH)12019.23Hz，采樣點數(TD)64K，采樣時間(AQ)2.73s，馳豫延遲時間(D1)20s，采樣次數(NS)16次，空掃次數(DS)2次，探頭溫度298K。在上述NMR采集條件下采集信號，進行相位調整和基線校正后，測定化合物1和化合物2以及對應內標物定量峰面積的相對比值，采用公式(1)計算化合物含量。

式中：P為待測樣品純度(%)；As為樣品定量峰的積分面積；ns為樣品定量峰代表氫原子數；Ms為樣品相對分子質量；ms為樣品質量(g)；Ar為內標峰的積分面積；nr為內標峰所代表氫原子數；Mr代表內標的相對分子質量；mr內標質量(g)；Wr為內標物的百分含量。

1.3 鄰苯二甲醛柱后衍生化HPLC分析

色譜柱：ZORBAXElipse XD B-C18( 250mm×4.6mm,5μm)；流動相A：0.025mol/L戊烷磺酸鈉溶液加0.1mol/L無水硫酸鈉水溶液(乙酸調pH3.5)，流動相B：甲醇；洗脫程序為流動相A：流動相B：95:5(V/V)；流速：0.9mL/min；檢測波長：330nm；柱溫：40℃；進樣體積：10μL；衍生化試劑：稱取15.6g氫氧化鈉和24.72g硼酸水溶解后加入4%鄰苯二甲醛乙醇溶液，水稀釋至2L，再加入2.0mL硫代乙醇酸混勻；衍生化試劑流速：0.6mL/min；衍生化溫度：55℃。

1.4 LC-LC/MS分析

色譜柱： Agilent ZORBAXSB -C18(4.6mm×250mm,5μm)；流動相A：0.3mol/L三氟乙酸水溶液，流動相B：乙腈；洗脫程序為流動相A:流動相B：96:4(V/V)；進樣體積20μL；柱溫40℃；流速：0.9mL/min；N2流速：2.0L/min；正離子掃描30min；掃描范圍：50～2000(m/z)。

2 結果

2.1 化合物1和化合物2的鄰苯二甲醛柱后衍生化HPLC分析

對化合物1和化合物2采用鄰苯二甲醛柱后衍生化HPLC分析，結果見圖1?；衔?除了保留時間Rt14.47min的主峰P1外，還含有至少5個雜質，雜質峰a、b、c、d、e的HPLC保留時間分別為Rt9.05、12.05、12.79、16.39和17.55min?；衔?除了Rt 12.17min的主峰P2外，也至少含有a'、b'、c'、d'、e' 5個雜質峰，Rt分別是7.71、8.91、10.67、13.2和15.32min。化合物1的色譜純度(n=3)為95.97%±0.16%，化合物2的色譜純度(n=3)為97.58%±0.02%，結果見表1。

2.2 NMR分析的溶劑選擇以及化合物1和化合物2的核磁譜圖歸屬和質譜分析

本實驗針對NMR常用溶劑進行實驗，發現化合物1、化合物2以及內標物在D2O有較好的溶解性，而且溶劑峰與樣品、內標物的吸收峰沒有發生重疊，因此選擇D2O做溶劑。

圖1 化合物1和2鄰苯二甲醛柱后衍生化HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of compounds 1 and 2 with postcolumn derivatization of o-phthaldialdehyde

表1 化合物1和2的HPLC純度測定Tab.1 Determination of compounds 1 and 2 by HPLC

對化合物2進行解析，由碳譜化學位移得季碳為C1'δ175.60，由HMBC譜可知氫譜中與C1'相關氫譜峰為δ3.87～3.84、δ4.11、δ1.95、δ1.80-1.74峰，結合其他圖譜可確定C1、C2'、C3'，并通過C3'的COSY效應確定C4'。H譜中位于低場的δ5.70、δ5.69為雙鍵C3'、C4'，δ5.25、δ4.95為異頭碳C1'、C1''，通過物質結構的分析可知只有H3'會與C1'產生HMBC遠程相關信號，依此可同時確定4個C的歸屬。由H1'、H1''可在HMBC譜中確定C4、C6，并結合COSY確定C2、C3、C5，由H3'、H4'、H1'可通過COSY確定H2'、H5'、H6'。III環各C可通過已確定的C1''和6''(因其余4個仲碳都已確定)通過COSY譜進行歸屬。表2為化合物2的13C NMR、1H NMR、1H1H-COSY和HMBC的核磁譜解析數據。

同理，由碳譜化學位移得季碳為δ179.09的C1'，由HMBC譜可得氫譜中與C1'相關的H峰，結合其他圖譜可歸屬C1、C2'、C3'，通過HSQC得到相連H的化學位移，并通過H3'的COSY效應確定H4'。除側鏈兩個仲碳外，δ63.08為與羥基相連的仲碳C6''，δ47.69為與氨基相連的仲碳C6'，在剩余3個仲碳中，從找到HNBC譜找到與異頭碳上的Hδ5.179或Hδ5.185遠程相關信號，可確定C3'和H1'(同時得到H1'')。結合其他二維譜確定C4'和C2。由H1'與H1''可在HMBC譜中確定C4、C6，并結合H4和H6的COSY信號確定同環的H2、H3、H5。由H3'、H4'和H1'結合各二維譜信息確定同環的H2'、H5'、H6'。III環各C、H可通過已確定的H1''和H6''，通過COSY譜顯示的同環自旋體系信息進行歸屬。

化合物1和化合物2的結構極為類似，化合物2的核磁譜解析見表2。

經MS鑒定化合物1和化合物2的分子離子峰[M+H]+分別為m/z553.5和551.4。碎片離子峰基本一致，[Ⅰ+Ⅲ+H]+為m/z425.1、m/z425.2，[Ⅰ+H]+為m/z264.0、m/z264.1，[Ⅲ+H]+為m/z162.9、m/z163.0。

經核磁和質譜分析，化合物1為3-氨基-3-脫氧-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-[2,3,4,6-四脫氧-2,6-二氨基-α-D-赤式-己吡喃糖基-(1→4)]-1-N-[(2S)-4-氨基-2-羥基-1-氧丁基]-2-脫氧-D-鏈霉胺，化合物2為3-氨基-3-脫氧-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-[2,3,4,6-四脫氧-2,6 -二氨基-α-D-赤式-3-烯-己吡喃糖基-(1→4)]-1-N-[(2S)-4-氨基-2-羥基-1-氧丁基]-2-脫氧-D-鏈霉胺?；衔?和化合物2屬于2-脫氧-D-鏈霉胺雙取代衍生物，其結構差異僅是己吡喃糖基上單鍵和烯鍵。圖2為化合物1和化合物2的化學結構。

表2 化合物2的核磁譜解析Tab.2 NMR analysis of compound 2

2.3 內標物、定量峰的選擇和含量測定

對分別加入內標物馬來酸、甲酸鈉的化合物1和化合物2進行1H NMR譜圖分析(圖3)，馬來酸易于識別的尖銳單峰δ6.23ppm歸屬為烯鍵氫，和化合物1的樣品峰分離完全，互不干擾，因此馬來酸可以作為化合物1的內標物。化合物1在δ5.05ppm、δ5.66ppm的位移是與氧代相連的碳C1'和C1''上的氫，是與其他信號分離的獨立尖銳單峰，因此選擇化合物1的δ5.05ppm、δ5.66ppm處的兩個單峰信號為定量峰。同理，甲酸鈉易于識別的尖銳單峰歸屬為δ8.36ppm，和化合物2的樣品峰不發生重疊，因此甲酸鈉可以作為化合物2的內標物?；衔?的δ2.00ppm位移是與C3'相連的-CH2，δ5.72ppm位移為烯鍵氫，這兩組尖銳單峰與其他信號峰分離完全，因此選擇該兩組峰為化合物2的定量峰(由積分方法可知，核磁內標計算含量的計算方法不夠詳細，有無減少認為誤差的措施)化合物1、2進行1H NMR內標法測定，樣品重復測試6次，化合物1和化合物2的含量分別為64.98%±2.38%和75.38%±2.82%。

圖2 化合物1和化合物2的化學結構Fig.2 Chemical structure of compound 1 and compound 2

圖3 化合物1、2和內標物的1H NMR相應峰Fig.3 1HNMR peak of compounds 1,2 and internal standards

3 討論

化合物1和化合物2屬于2-脫氧-D-鏈霉胺雙取代衍生物，是第三代氨基糖苷類抗生素合成過程中的重要中間體。這兩個化合物是結構非常接近的類似物，但分子結構中己吡喃糖基上單鍵和烯鍵的差異，使化合物的極性發生改變，因此無紫外吸收的化合物1和化合物2在鄰苯二甲醛柱后衍生化HPLC分析中有較好的區分度，但無法購買商業化標準品是HPLC法定量測定的障礙?；衔?和化合物2的HPLC色譜純度均大于95%，但由于樣品易吸水、成鹽性和雜質等干擾，色譜純度并不能真正反映化合物1和2的濃度，需要提供足夠量的樣品以測定樣品的水分及熾灼殘渣。qNMR具有樣品制備簡單、無需標準品、準確、專一性高和不破壞樣品等優點，是定量測定研發過程中樣品量少且無商業化標準品化合物的有效方法。在qNMR分析中，弛豫延遲時間、激發脈角度、采樣次數是影響定量的主要參數[9-10]。激發脈沖角度越小需要的弛豫延遲時間越短。本實驗經過比較，在保證基線平直和高信噪比的條件下，激發脈沖角度30°、弛豫延遲時間20s、掃描次數選擇16次時，樣品和內標物馬來酸、甲酸鈉的定量峰積分可以滿足準確度的要求。D2O對樣品和內標物有較好的溶解性，且不產生干擾，因此選擇D2O作為qNMR的溶劑。化合物1和化合物2的定量峰選擇峰形較好，周圍沒有干擾的峰。內標物馬來酸δ6.23ppm的烯鍵氫峰、甲酸鈉δ8.36ppm的氫峰與所測樣品的定量峰分離良好，且不產生干擾，因此選擇馬來酸和甲酸鈉作為內標物。

越來越多的研究報道了qNMR測定的化合物濃度與質量平衡法濃度高度一致。qNMR法可以克服HPLC法缺少標準品帶來的困擾，定性分析和定量分析可同步完成，方法簡單、準確，為氨基糖苷類新藥合成的過程檢測和質量控制提供有效的技術手段。