多黏菌素B藥敏條在腸桿菌科藥敏檢測中應用研究

鄭業煥 李軼 金湘東 荊鵬偉

(1 鄭州安圖生物工程股份有限公司，鄭州 450016；2 河南省人民醫院，鄭州 450003；3 鄭州鐵路職業技術學院，鄭州 450052；4 河南中醫藥大學第一附屬醫院，鄭州 450008)

腸桿菌科細菌是革蘭陰性菌中非常重要的一類微生物，是引起臨床感染的重要病原菌之一，可致化膿性疾病、肺炎、腦膜炎、菌血癥以及傷口、泌尿道和腸道的感染[1-2]。多黏菌素是從多黏類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)培養液中獲得的多肽類抗生素，根據化學結構共分為5型，其中僅B和E應用于臨床，主要用于治療革蘭陰性菌所致的全身多位點感染，因其較嚴重的腎毒性及神經系統毒性曾經一度被棄用。近年來，隨著抗生素的廣泛應用，腸桿菌科細菌對多種抗菌藥物產生了耐藥性，多黏菌素類作為治療的最后選擇又被應用于臨床[3-4]。本研究結合最新2018版美國臨床實驗室標準化研究協會(CLSI)M100-S28標準[5]，收集了2018年上半年河南省人民醫院、河南省中醫一附院、鄭州大學二附院臨床分離腸桿科菌株887株，同時采用E-test法和微量稀釋法進行體外藥敏試驗，考察兩種方法的一致性，為臨床腸桿菌科細菌體外多黏菌素藥敏試驗提供參考，指導臨床合理進行體外藥敏檢測。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

本研究收集了2018年1月—6月河南省人民醫院、河南省中醫第一附屬醫院、鄭州大學第二附屬醫院臨床常規分離腸桿科菌株887份，其中埃希菌屬331株，克雷伯菌屬207株，沙門菌屬103株，志賀菌屬112株，其他屬腸桿菌134株(腸桿菌屬57株，檸檬酸桿菌屬48株，耶爾森菌屬13株，摩根菌屬7株，布丘菌屬6株，西地西菌屬3株)。質控菌株采用ATCC標準菌株：大腸埃希菌(ATCC25922)、產酸克雷伯菌(ATCC700324)、肺炎克雷伯菌(ATCC700603)、肺炎克雷伯菌肺炎亞種(ATCC13883)、腸炎沙門菌(ATCC13076)、鼠傷沙門菌(ATCC14028)、索氏志賀菌(ATCC25931)、霍氏腸桿菌(ATCC700323)、人蒼白桿菌(ATCC49687)、人蒼白桿菌(ATCCBAA-749)均源于鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.2 試劑

多黏菌素B藥敏條由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供，血瓊脂平板、90mm Mueller-Hinton(MH)平板均由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供。多黏菌素B抗菌藥物為標準品，購自中國食品藥品檢定研究院；MH肉湯購自于BD醫療器械(上海)有限公司。

1.3 方法

按照多黏菌素B藥敏條說明書進行操作。待測菌株和質控菌株分純過夜，挑取純菌落制備濁度為1.5×108CFU/mL濃度菌液，用無菌棉簽浸蘸菌液涂布于90mm MH平板表面，放置5min后，用真空吸筆吸取藥敏條放置于平板上然后放置(35±1)℃孵育，孵育16～20h后，讀取抑菌圈邊緣與藥敏條相交位置處的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)值。微量稀釋法的操作和判讀參照CLSI標準：在96孔酶標板的2～12孔各加100μL肉湯培養基；加100μL含64μg/mL抗生素的肉湯培養基至第1和第2孔中；從第2～12孔作對倍稀釋；加100μL含有105CFU待檢細菌新鮮肉湯培養基于每一孔；設立陽性對照孔，陰性對照孔，抗生素對照孔；密封酶標板，(35±1)℃環境下孵育20～24h，當陽性對照孔明顯渾濁時，記錄MIC值。EA(essential agreement)：指待測方法與對比方法(或參考方法)MIC值在±1個稀釋倍數范圍內的一致性[5-7]。藥敏條與微量稀釋法比對超過±1個稀釋倍數時進行復測，復測仍然超過±1個稀釋倍數判為不一致[7]。

1.4 統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，P＞0.05為無顯著性差異。

2 結果

2.1 質控菌株檢測結果

本次質控選用的9株ATCC標準菌株，均重復3次檢測，其中僅大腸埃希菌ATCC25922在CLSI有質控范圍為0.5～2μg/mL，采用微量稀釋法和藥敏測定MIC值均在±1個稀釋倍數范圍內，符合性能要求，具體數據見表1所示。

2.2 樣本結果分析

共計887株腸桿菌的比對中，873株用藥敏條和微量稀釋法測定MIC值在±1個稀釋倍數的范圍內。其中完全一致的有594株(594/887,66.97%)，±0.5個稀釋倍數的有170株(170/887,19.17%)，±1個稀釋倍數的有86株(86/887,9.70%)。有45株菌的MIC值超出了±1個稀釋倍數，EA%為94.93%(842/887)，針對第一次測定不符合的經復測確認，有36株菌測定結果仍然不符合，即糾正后的EA%為95.94%(851/887)，結果見表2所示。

表1 標準菌株重復3次檢測結果Tab.1 Test results for standard strains repeated three times

2.3 不一致結果分析

兩種方法MIC值超過|±1|個稀釋倍數的36株，測定MIC值見表3所示，相關性分析：P=0.012＜0.05，說明藥敏條檢測結果與微量稀釋法檢測結果具有顯著的線性相關。配對檢驗結果中的P＞0.05，說明兩者結果差異不明顯。

表2 兩種方法所測MIC值EA結果Tab.2 EA results of MIC values measured by two methods

2.4 不同類間分析

針對887株腸桿菌科細菌按照不同種屬分類，計算其EA一致性，埃希菌屬的EA為95.77%(317/331)，克雷伯菌屬的EA為96.14%(199/207)，沙門菌屬的EA為97.09%(100/103)，志賀菌屬的EA為96.43%(108/ 112)，其他屬腸桿菌的EA為94.03%(126/134)，并對這5種進行顯著性差異分析，結果見表4所示。

3 討論

目前，體外抗菌藥物敏感性試驗技術主要包括紙片擴散法、微量肉湯稀釋法、商品化全自動微生物分析系統(如Vitek-Compact,BD Phoenix)和E-test法等。其中，紙片擴散法操作簡單、對實驗室要求較低，且花費較低，適合臨床實驗室尤其是基層醫院使用[8-9]。微量肉湯稀釋法是美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)推薦的參考方法，但該方法操作繁瑣，暫無全自動系統出現，并且板卡抗菌劑種類固定，影響臨床推廣使用。商品化全自動微生物分析系統使用方便，但價格較昂貴且需要特殊儀器設備、抗菌藥物選擇相對固定、測定濃度范圍較窄[10]，故在常規應用中存在一定局限性。E-test法則綜合了MIC法與紙片擴散法的優點，操作簡單、可得到具體的MIC值、測定濃度范圍寬、可選擇的藥物較多等，近些年來逐漸受到了實驗室的認可。然而多黏菌素在瓊脂中不易擴散導致該方法可靠性降低[3]，2018版CLSI M100-S28中針對黏菌素(多黏菌素B)藥敏體外檢測新增備注說明，針對銅綠假單胞菌和不動桿菌建議采用的微量肉湯稀釋法，刪除紙片擴散法和E-test法折點范圍，備注說明，不建議采用紙片擴散法和E-test法藥敏條。本研究參考指南，采用ATCC標準株進行平行體外藥敏試驗，ATCC菌株確保檢測的可溯源性，質控菌株檢測結果均一致，即E符合率為100%，說明了試驗結果的有效性。

表3 超過|±1|個稀釋倍數36株臨床菌株檢測MIC值Tab.3 The MIC outside |±1| dilution ration of 36 clinical strains

表4 腸桿菌科不同屬檢測EA一致性分析Tab.4 EA consistency analysis of different genus of Enterobacteriaceae

本研究對887株腸桿菌科細菌，分別采用微量肉湯稀釋法、E-test法進行體外藥敏試驗，測定抗菌藥物的MIC，并統計分析兩種方法檢測MIC的一致性。共計887株腸桿菌的比對中，有45株菌的MIC值超出了|±1|個稀釋倍數，經復測確認，有36株菌測定結果仍然不符合，即糾正后的EA%為95.94%(851/887)。統計學χ2方檢驗，采用P＞0.05，二者無顯著性差異，針對復測后36株菌株的一致性超過±1個稀釋倍數，推測可能是方法學或菌株的差異所致，也可能與藥敏檢測所用MH培養基的pH值、組分差異有關[3]。針對887株腸桿菌科細菌按照不同種屬分成5類進行分析，EA值最高的為沙門菌屬的97.09%(100/103)，EA最低的為其他屬腸桿菌的94.03%(126/134)，并對這5種進行顯著性差異分析，P=0.801＞0.05，美國食品藥品監督管理局(FDA)標準[11]中對藥敏檢測試劑性能評價要求與微量肉湯稀釋法比對大于90%，該研究中比對一致性均高于94%，說明腸桿菌科細菌使用E-test法藥敏條試劑是性能滿足預期要求。針對36株臨床菌檢測MIC值，相關性分析：P=0.012＜0.05，說明藥敏條檢測結果與微量稀釋法檢測結果具有顯著的線性相關，配對檢驗結果中的P＞0.05，說明兩者結果差異不明顯。

體外藥敏試驗是臨床選擇抗菌藥物治療的重要參考依據，準確的藥敏試驗對臨床極為重要。目前全世界關于多黏菌素的E-test法耐藥值折點問題仍無統一認識，而多黏菌素將越來越廣泛地應用于臨床多重耐藥革蘭陰性菌感染的治療。在本研究中，多黏菌素B藥敏條用于腸桿菌科檢測時，E-test法和微量稀釋法具有很高的一致性，說明E-test法多黏菌素藥敏條可用于臨床腸桿菌科體外藥敏檢測。