生物消油劑的研發及應用進展

王昕喆，謝諺，楊洋洋，張福良，閆茜，曲聰，盛學佳

(中國石油化工集團公司青島安全工程研究院，山東 青島 266100)

目前針對頻發的海上溢油事故，主要的應急方法有控制燃燒法、機械回收法、消油劑法三大類。控制燃燒法快速有效，但是使用條件較為苛刻，考慮因素包括油品種類的燃燒性能、油品剩余揮發分含量以及油膜厚度等；機械回收法則有可實現資源回收的優點，但是回收效率往往很低，相比之下，消油劑則消除溢油效果明顯，操作快速簡單，但由于目前市面上大多為化學消油劑，大量噴灑會造成二次污染，因此已被明確限定使用。

生物消油劑的研發則有效彌補了化學消油劑的缺點，由于其本質為微生物或酶組分制劑，因此無二次污染、易于生態修復。但是經過調研發現目前市面上成熟生物消油劑產品種類較少，針對生物消油劑的研發仍大多集中于實驗室的基礎研究。基于上述情況，本文針對生物消油劑目前的研究現狀進行了資料收集與分析整理，介紹了生物消油劑的發展現狀與主要研究熱點，并指出生物消油劑下一步的重點研究方向。

1 消油劑現狀

1.1 生物消油劑種類

目前，生物降解石油的原理主要分為三類：一是利用高產表面活性劑菌種或其產生的生物表面活性劑，加快石油類物質的溶解乳化，促進石油烴大分子變成小分子，幫助本土微生物對石油類物質的代謝[1]；二是通過添加生物刺激劑，例如N/P等營養素刺激本土微生物的菌種繁殖和代謝[2]；三是直接添加本土或外源以石油類物質為碳源的高效石油降解菌，改變污染區域的菌群結構，提高石油降解菌占比，提高降解速率[3]。生物消油劑的主要基底成分也基本由三種組成：生物表面活性劑或高產表面活性劑的菌種、生物刺激劑以及高效石油降解菌。

生物表面活性劑大多是由微生物代謝產生的一種具有表面活性的物質，可以有效降低兩相界面的張力。能夠乳化油品，有效加速石油類物質的溶解。根據結構特征可以把生物表面活性劑分為脂肽類和脂蛋白類、糖脂類、磷脂類和脂肪酸類、中性脂類等[4]。目前文獻報道的高產表面活性劑的菌種主要為假單胞菌屬(Pseudomonas)、地衣芽孢桿菌屬(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢桿菌屬(Bacillussubtilis)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、屎腸球菌屬(Enterococcusfaecium)等[5]。Rocha等報道了銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC55925)可以產鼠李糖脂，能夠有效降解直鏈烷烴C11～C21，降解率近乎可達100%[6]。典型生物表面活性劑及其來源微生物見表1。生物刺激劑的主要成分則為營養鹽，石油中有豐富的碳源，N/P類的營養鹽進入后可明顯影響本地石油降解菌的生長繁殖，提高石油降解菌的降解效率。趙東風等[7]對克拉瑪依石油污染土壤的修復研究中發現，雞糞、麥糠、表面活性劑的定比例組合可以大大提高土壤修復速率。郭婷等[8]通過在混合菌劑中加入腐殖酸、肥料和生物有機鈣等營養鹽，加快了石油烴的去除效率。高效石油降解菌根據目前的研究，已知的就有100余屬200多種，涵蓋細菌、放線菌、霉菌、酵母等，主要包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、食烷菌屬(Alcanivorax)、解環菌屬(Cycloclasticus)等[9]。Wang等[10]則從重度含油污水灌溉區土壤中分離出分枝桿菌(Mycobacteriumsp.B2)，經過實驗發現其對芘的生物降解率30 d可達到83.2%，很適宜用作生物修復。

表1 常見生物表面活性劑類型及其來源微生物Table 1 Types of common biosurfactants andtheir source microorganisms

1.2 主要固定化方式

生物固定化是得到生物消油劑產品的關鍵技術。它能夠使微生物固定于特定環境，保證微生物的高密度存活，降低微生物流失或不可控擴散，是工程應用的前提[16]。目前的生物固定化方式主要為靜電吸附法[17]和載體法[18]。靜電吸附法主要是依靠靜電作用與微生物的吸附作用，反應條件比較溫和，微生物活化也比較快速。載體法主要是將微生物與載體材料相結合，對載體材料的要求較高，要求載體材料無毒、高穩定性。宋佳宇等[19]采用的固定方式為將生物載體材料改性(聚丙烯工業吸油棉)與生物消油劑基底進行離心固定，得到的生物制劑對石油烴的降解率明顯高于游離態菌種降解率。目前使用較多的載體材料為活性炭和苧麻，因為其有大的吸附能力，好的傳質性能與良好的生物降解性能[20-21]，姜軍清等[20]在總結活性炭纖維應用研究進展時提到活性炭纖維可作為生物固定化載體用于污水處理，傳質效能快、吸附容量大。郭賀等[21]則通過將苧麻用乙酸改性，發現其對溢油的吸附性能大大增加，是比較好的天然生物載體材料。Li等[22]加入活性炭固定化的微生物，在低濃度背景下，烴類降解率穩定在70%以上，明顯優于游離微生物。張秀霞等[23]利用納米氧化硅對石油降解菌進行固定，多次重復實驗發現固定后明顯提高菌群對石油烴的降解效果。

1.3 國內外現有產品

目前市面上的生物消油劑產品不多。國外的生物消油劑產品主要集中于生物表面活性劑的研發。Logos Technologies公司推出NatSurFact系列可降解表面活性劑，其原料為鼠李糖脂，鼠李糖脂也是最早的應用于土壤修復的一種生物表面活性劑[11]。但由于生產和提純成本較高，定價也很高，純度95%的鼠李糖脂市場價格為200～227美元/10 mg，根據不同的用途可生產不同級別的生物表面活性劑。同樣在開發鼠李糖脂的國外公司還包括AGAE技術公司、Rhamnolippid公司、GlycoSurf公司和TensioGreen公司等。

國內的生物消油劑產品種類較少，大連英達石化有限公司的MD-88A產品，其主要成分是生物型表面活性劑，不含有N/P等刺激劑，也不易燃，已獲得國家海事局許可并以(海船舶[2011]861號)文件的形式向全國各直屬海事局予以發布；中海石油環保服務(天津)有限公司也開發出已獲國家海洋局北海分局頒發的使用核準證書的生物環保消油劑。中國大慶沃太斯化工也在鼠李糖脂生物表面活性劑上持續開發，但國內未上市，僅出口北美。

目前在已發生的事故中生物消油劑已得到部分應用，Swannell等[24]在Exxon油輪溢油事故中使用生物修復劑Inipol EAP22對威廉王子灣進行了修復，達到了很好的效果，其主要成分為N/P營養鹽。但營養鹽的加入會加速海水的富營養化，因此近些年在使用上也被較多限制。鄭立等[25]實驗表明，“7.16大連溢油”事故中通過投加石油降解菌劑DC10，將石油降解效率提高了60%。 Pekdemir等[26]則使用以鼠李糖脂為代表的5種生物表面活性劑和一種化學表面活性劑的組合菌劑，用來處理Ekofisk地區的土壤石油污染，效果非常明顯。

2 主要研究方向

2.1 高效石油降解菌的篩選及穩定性研究

實驗室內高效石油降解菌種的篩選研發一直以來都是生物消油劑方向的熱門研究，朱杰[27]從石油污染土壤中提取分離得到28株石油降解菌，發現其中能對石油降解效率達到40%以上的主要為假單胞菌屬(Pseudomonas)，田永娥等[28]則從含油廢水提取石油降解菌，之后進行實驗室培養純化，研究表明該菌種7 d左右的生物除油率可達到50%左右。環境因素，包括溫度、營養鹽、pH、溶解氧、石油烴理化性質等都將嚴重影響石油降解菌種的生存與繁殖，因此通過將提純菌種的外部環境進行大量單因素變量實驗，從而得到其降解石油烴的最佳環境也成為研究者的一大重要工作[29]。

隨著基因工程的快速發展，石油降解菌的主要石油烴代謝基因也在不斷被發現，使篩選更加高效。楊智等[30]研究了3株石油降解紅球菌的主要石油烴代謝基因，主要為烷烴單加氧酶基因、芳香烴雙加氧酶基因和鄰苯二酚雙加氧酶基因。孫敏等[31]從柴油污染海水中分離出一株高效柴油降解菌，并對其基因組進行了分析，發現擴增出了CYP-153A相關基因，并發現該種基因主要存在于能夠降解中長鏈烷烴的菌種中，并對該基因起到的主要作用進行了探究。

穩定性研究方面，目前對于菌種保藏常見的方法是真空冷凍干燥法，但是真空冷凍干燥法會逐漸降低生物菌種的活性，超過5年之后會穩定在一個較低的活性水平。田燕等[32]基于TA 克隆分析石油微生物多樣性基礎上直接關注于菌種活性與冷藏時間的關系，提選出最適宜冷藏保存的菌種。

2.2 特殊環境下菌種篩選與研發

目前對本土菌種的篩選與純化已經較為成熟，但是一般環境下提純出的菌種遇到極端環境往往無法正常存活，生存競爭力明顯下降，生長繁殖速率減慢起不到高效的石油降解作用。因此研究方向開始集中于特殊環境下的菌種篩選與條件優化，例如高原凍土區、海洋低溫環境等，常見極端環境下石油降解菌種研究匯總見表2。

表2 極端環境下石油降解菌種研究Table 2 Study on petroleum degradation strains in extreme environments

青藏高原地區為季節性凍土區，常年低溫，生態脆弱，王藝霖等[43]從青藏高原地區土壤中篩選出一株具有原油降解功能的細菌，低溫條件下降解率可以達到71.5%。溫成成等[41]則于實驗室構建凍土地區環境，對機油柴油等進行土著微生物的篩選及馴化，然后進行菌群的土壤修復模擬。目前篩選出的低溫降解菌，主要來自極地海洋環境。邱雪等[42]則從我國海域篩選出4株可產表面活性物質的低溫石油降解菌，表面活性物質的主要種類為糖脂類，可在0 ℃左右高效降解石油。李兵等[44]則通過對遼河油田低溫石油樣品進行富集分離，報道出首次出現的嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，可以達到低溫下10 d對石油烴類的降解達到80%以上，高于之前已知菌種的降解效率。

2.3 復合菌群構建

研究表明，同一菌種往往僅對一種或幾種烴類有明顯降解作用，且不同烴類的降解難度從易到難一般為：直鏈烷烴>支鏈烷烴>環烷烴>多環芳烴>雜環芳烴。由于石油產品都是成分復雜的混合物，因此復合菌群對石油產品的降解能力明顯強于單一菌種。如何進行復合降解菌群的構建成為了生物修復石油污染土壤或石油廢水的一大重要研究領域。王鐵媛等[45]從吉林油田油水淹地污染土壤中篩選出26株石油降解菌，其中包括產表面活性劑的菌種以及石油降解菌種。通過優化篩選，最終獲得10株優勢菌株并構建了石油降解菌群。管亞軍等[46]則復合了6個菌種組成的混合菌群用于處理油田污水，并利用氣相色譜儀分析了各組成菌在降解原油中的作用和效果，挑選出關鍵菌株和輔助菌株。范瑞娟等[47]則從大慶油田石油污染土壤中獲得6株分別具有環烷烴、直鏈烷烴和芳烴降解能力的菌株，菌群構建后可實現對三類烴：環十二烷、十六烷、芘的去除具有明顯促進作用。

3 難點與下一步研究重點

3.1 產品級別的生物消油劑研發

關于生物消油劑方面的實驗室研究從20世紀80年代就陸續開展，對于生物降解石油菌種的機理研究、種類研究、環境條件研究已非常成熟。但是產品級別的生物消油劑非常少，部分生物表面活性劑的產品應用成本非常高。可能的原因如下：①以石油降解菌為主要成分的產品在使用過程中效果較為緩慢，且環境適用性差，難以保證在污染環境下的處理效果，難以滿足在事故或應急條件下投入使用并快速生效的要求；②生物表面活性劑產量低、生產成本相對較高，限制了其大規模工業化應用，市場份額小[48]；③目前國家政策對消油劑產品采取嚴格限制使用的政策，且消油劑產品主要用于應急事故使用，使用門檻高受眾面窄，市場需求相對較小。因此如何有效提高生物表面活性劑的產量和活性、降低生產成本或尋求一種能夠使石油菌種快速成活，在本土微生物系統中能夠有競爭力并快速繁殖的技術，仍然是目前研究的熱點。

3.2 大的示范場地的生物菌種適應性測試

目前實驗室的菌種培養、富集、篩選技術已非常成熟，但是實驗室的條件太為理想，無法模擬復雜的實際外環境，忽略了其他類本土微生物的強大競爭力。本土石油降解菌往往容易適應本土環境，存活率高，但是在有限資源條件下無法達到預期豐度，在出現石油碳源的情況下有很大的降解潛力，但降解速度與繁殖速度都遠遠低于實驗室條件[49]。外源微生物則由于與本土微生物的競爭能力低下，環境的適應性差，往往在修復場地無法快速形成降解規模，單純從實驗室無法進行實際情況的有效模擬[47]。因此，對菌種的培養與適應性測試場所，應從實驗室擴大到有石油污染背景的示范場地，實現企業與高校的緊密合作，將菌種適應性與土壤條件、氣候條件、微生物競爭情況相綜合，實現多因素考察。

3.3 復合菌群縱向構建

目前針對于石油這種復雜污染物進行菌群復合研究的較多。但是往往集中于橫向復合，即組合對石油中不同組分進行降解的菌種群落構建。但是未考慮該菌群對于初步降解后產生的中間產物失去了進一步高效降解的能力，導致石油類物質無法高效降解徹底。烷烴生物降解基本可分為醇、醛、酸，最后到CO2和H2O；芳香烴則主要在加氧酶的催化下先開環形成易降解的直鏈烴。因此，應結合生物降解石油機理，將菌種進行縱向復合，即可對不同階段的降解產物進行二次降解的菌種進行復合，保證石油類物質在不同降解階段都有其對應的高效降解菌種存在，實現石油類物質徹底降解。

4 結束語

生物消油劑有其不可替代的應用場景，其無二次污染物引入、清潔高效的優點，使其成為生態修復或溢油應急的有效手段。但是目前市場上仍未有成熟的生物消油劑產品，經過文獻調研與分析，以下幾個方向可成為未來突破生物消油劑從實驗室研究到現場廣泛應用的有力推手：①生物表面活性劑的低成本高產量方向研究；②大示范場地生物消油劑應用效果研究；③復合菌群從中間產物角度的縱向復配研究。