伊曲康唑對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠骨髓源性抑制細胞的影響及意義

黎媛 李偉文 藍秀 呂祝慶

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是臨床上常見的不可逆性呼吸道順應性下降的慢性肺部疾病[1]，其發病機制與持續炎癥反應、氧化應激以及蛋白酶功能紊亂等有關。一些研究發現免疫功能紊亂，尤其是CD4+和CD8+T 細胞免疫功能紊亂是導致呼吸道黏膜上皮損害的重要原因[2]。近年來，有研究表明骨髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）除了參與腫瘤微環境免疫抑制外，還與COPD 等炎癥性疾病密切相關。MDSC 在COPD 疾病進展中的作用仍存在較大爭議[3-4]。免疫調節劑（如胸腺肽）可緩解COPD 病情，減少急性發作，其作用機制是否與MDSC 狀態有關仍需進一步探討。伊曲康唑是一種廣譜抗真菌藥物[5]，可明顯改善COPD 合并真菌感染患者的病情[6]。由于缺乏臨床用藥指征，伊曲康唑仍未應用于治療非真菌感染性COPD 患者。近年來，越來越多的學者發現伊曲康唑具有廣泛的非抗真菌作用，如抗腫瘤、抗炎、抑制血管生成、調節細胞自噬、免疫調節等[7-10]，但其對無真菌感染性COPD 患者的MDSC 的影響仍未明確，因此，本研究觀察伊曲康唑對COPD 模型大鼠MDSC 的影響及意義，以進一步闡明伊曲康唑治療COPD 的內在機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 40 只6～8 周齡健康雄性SD 大鼠，許可證號：SCXK（浙）2015-009，體重約200～250g，購自溫州醫科大學實驗動物中心。

1.2 主要材料 人淋巴細胞分離液Ficoll-Hypaque 購自北京普博斯生物科技有限公司；Anti-Ly6g（Gr-1）、Anti-CD11b 抗體均購自中國Abcam 公司；誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）、轉化生長因子-β（TGF-β）、精氨酸酶1（ARG1）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體均購自美國CST 公司；伊曲康唑購自上海阿拉丁試劑有限公司；增強化學發光（ECL）試劑盒購自美國Thermo 公司。

1.3 構建COPD 模型及實驗分組 按隨機數字表法將40 只大鼠分為對照組、模型組、低劑量組和高劑量組4組，每組10 只。對照組給予常規喂養，后3 組按被動香煙煙霧吸入法構建COPD 模型[11]，低劑量組和高劑量組大鼠于被動吸煙12 周后，分別口服10mg/kg 和50mg/kg伊曲康唑，1 次/d，共4 周。

1.4 大鼠氣道阻力和順應性檢查 建立模型16 周后，采用腹腔注射10%水合氯醛溶液（3.8ml/kg）將大鼠麻醉，進行氣管插管并連接到流速傳感器，采用小動物肺功能監測系統觀察大鼠呼吸的流量和壓力曲線，測量并計算第0.3s 用力呼氣量與用力肺活量的比值（FEV0.3/FVC）、肺順應性和氣道阻力，測量完成后采用空氣注射法處死大鼠，為后續試驗準備。

1.5 小氣道病理學評分 按照文獻[12]中的方法，取左肺組織，以4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，切片，HE染色后，由經驗豐富的工作人員閱片，觀察以下指標：（1）小氣道腔內黏液和細胞阻塞情況，取阻塞小氣道的百分比；（2）小氣道上皮壞死糜爛的百分值；（3）上皮細胞杯狀化生程度；（4）上皮細胞鱗狀化生程度；（5）炎癥細胞浸潤程度；（6）組織增生程度；（7）平滑肌增生程度；（8）色素沉著程度。3～8 項按正常為0 分、輕度為1 分、中度為2 分、重度為3 分進行評分，將所觀察的小氣道評分值相加后，與最大總分數（即3×小氣道數）的比值即為小氣道病理學評分值。

1.6 外周血中MDSC 比例檢測 采用流式細胞儀技術。按照實驗分組構建模型，并給予伊曲康唑治療16周。收集各組大鼠的外周血液，按照密度-梯度離心法分離各組大鼠的單個核細胞，加入抗體CD11b 和Gr-1，冰上避光孵育20min，采用流式細胞技術分析Gr-1+CD11b+MDSC 比例。

1.7 肺組織中MDSC 計數檢測 采用細胞免疫熒光技術。提取肺組織細胞后，以4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、切片、脫蠟，用0.3%甲醇-過氧化氫溶液滅活內源性過氧化酶，并用0.1mol/L 檸檬酸鹽緩沖液抗原修復。10%山羊血清在37℃濕盒內處理30min。加一抗抗體，濕盒中，37℃孵育1h，4℃過夜；漂洗2 次后，加入二抗抗體，濕盒中，37℃孵育1h，漂洗2 次，加入顯示液避光顯色15min，終止反應；蘇木精對比染色、脫水、透明、封固、光鏡觀察3 個視野，統計細胞數，并計算平均值。

1.8 iNOS、TGF-β、ARG1 蛋白表達水平檢測 采用Western blot 法。收集適量的右肺組織，并制成勻漿后，加入適量的組織裂解液，冰上裂解10～15min，4℃離心機中，以12 000r/min 離心15min，取上清液。經蛋白定量后，取20μg 總蛋白4%～12%聚丙烯酰胺凝膠中，電泳分離；經電轉膜后，用3%脫脂牛奶室溫封閉30～60min。加入一抗（iNOS、TGF-β、ARG1），4℃孵育過夜；TBST 緩沖液洗滌，每次8～10min，共3 次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1～2h，TBST 緩沖液洗膜，每次8～10min，共3 次，用增強化學發光試劑發光、顯影和定影，Image J 軟件計算條帶的灰度值，以β-Actin 為內參。上述實驗重復3 次。

1.9 iNOS、TGF-β、ARG1 mRNA 表達水平檢測 采用RT-PCR 法。收集新鮮的病變肺組織，加入適量的Trizol液，提取總RNA，并合成cDNA。用AccuPowerRGreenstarTMqPCR PreMix 試劑盒配置20μl 的總反應體系，包括：cDNA 1μl、上下游引物各0.8μl，qPCR PreMix 10μl，0.9%氯化鈉溶液7.4μl，進行PCR 擴增。擴增條件：95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃退火延伸34s，溶解65～95℃，每5s 上升0.5℃；使用2-△△Ct表示基因表達情況。引物系列見表1。

1.10 統計學處理 采用SPSS 22.0 統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

表1 引物序列

2 結果

2.1 4 組大鼠FEV0.3/FVC、肺順應性、氣道阻力及小氣道病理學評分比較 與對照組相比，模型組FEV0.3/FVC和肺順應性明顯降低，氣道阻力和病理評分明顯增高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與模型組相比，低劑量組和高劑量組FEV0.3/FVC 和順應性明顯增高、氣道阻力和病理評分明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 4 組大鼠FEV0.3/FVC、肺順應性和小氣道阻力及氣道病理學評分比較

2.2 4 組大鼠MDSC 在外周血的比例和肺組織中計數比較 與對照組相比，模型組外周血MDSC 比例和肺組織中計數均明顯增高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與模型組相比，低劑量組和高劑量組外周血MDSC 比例和肺組織中計數均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表3。

表3 4 組大鼠MDSC 在外周血的比例和肺組織中計數比較

2.3 4 組大鼠肺組織中iNOS、TGF-β、ARG1 表達水平比較 與對照組相比，模型組iNOS、TGF-β、ARG1 蛋白和mRNA 表達上調，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與模型組相比，低劑量組和高劑量組iNOS、TGF-β、ARG1 蛋白和mRNA 表達上調明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表4、圖1。

3 討論

自1980 年首次成功合成后，伊曲康唑通過其三唑環結構阻斷真菌細胞膜麥角固醇的合成來抑制真菌生長，從而發揮其抗真菌藥物的作用，臨床上常用于治療淺表真菌感染及深部真菌引起的系統感染，具有良好的療效和較低的毒性。在COPD 合并真菌感染治療中，伊曲康唑亦可使患者獲得較好的臨床療效[6]。本研究結果提示，單一的伊曲康唑可改善COPD 大鼠的肺功能，減輕大鼠氣道炎癥反應，具有抑制肺部炎性損傷作用，提示伊曲康唑具有潛在的治療COPD 的作用。

表4 4 組大鼠肺組織中iNOS、TGF-β、ARG1 表達水平比較

圖1 4 組大鼠肺組織中iNOS、TGF-β、ARG1 表達的電泳圖

MDSC 是一群由髓源性祖細胞在不同階段分化的未成熟異質性細胞群，缺乏成熟性中性粒細胞、巨噬細胞或樹突細胞的細胞表型，其鼠源性MDSC 表型以Ly6g（Gr-1）和CD11b 為標志，人源性MDSC 表型則為LIN-HLA-DR-CD33+或CD11b+CD14-CD33+[13]。在炎癥性疾病、創傷應激、自身免疫疾病、膿毒癥，尤其是腫瘤微環境中，MDSC 可通過分泌ARG1 和iNOS，增加局部氧自由基含量和炎性細胞因子（如TGF-β），降低L-精氨酸的含量，抑制T 細胞增殖和免疫功能。此外，MDSC還可以直接與調節性T 細胞、Th1 細胞相互作用，起到間接免疫抑制作用[13-15]。近年來，越來越多的研究發現非腫瘤性肺部疾病中，如肺纖維化、肺動脈高壓、急慢性肺炎均具有不同程度的免疫功能紊亂的現象，且其機制可能與MDSC 的免疫抑制作用有關[16-17]。有學者發現COPD 患者的外周血中MDSC 比例明顯增加，且伴隨有調節性T（Treg）細胞比例增加和T 細胞功能紊亂，這提示MDSC 參與COPD 患者免疫調節的過程[13]。本研究在構建的COPD 大鼠模型中也發現外周血MDSC 比例及肺組織中MDSC 計數均較對照組明顯增高，肺組織中iNOS、TGF-β、ARG1 表達也明顯增高，提示MDSC 可能與COPD 疾病發生、發展有關。在經過低劑量和高劑量的伊曲康唑治療后，外周血MDSC 比例、肺組織中MDSC 計數和iNOS、TGF-β、ARG1 均明顯下降，提示伊曲康唑對MDSC 具有調節作用。

通過本研究，筆者初步證實了在COPD 大鼠模型中，外周血MDSC 比例、肺組織中MDSC 計數以及其分泌的細胞因子（包括iNOS、TGF-β、ARG1）明顯增加。而伊曲康唑可改善COPD 大鼠的肺功能，減輕肺部炎癥性反應，具有抑制肺部損傷作用，但由于實驗過程中未涉及到伊曲康唑是否參與MDSC 抑制T 細胞功能的研究，因此仍未明確伊曲康唑對COPD 免疫抑制狀態是否有影響，需進一步研究證實。

綜上所述，伊曲康唑降低COPD 大鼠的MDSC 比例以及細胞因子，有助于改善COPD 大鼠的肺功能、減輕氣道炎癥反應關。