脂聯素抑制糖尿病小鼠結直腸癌生長轉移及機制研究

李鑫 徐潔 潘月龍

肥胖、高胰島素血癥和胰島素抵抗已被認為是結直腸癌及腺瘤的重要危險因素。胰島素/胰島素受體通路的過度激活能促進有絲分裂和血管生成，是結腸癌發生的早期步驟[1]。脂聯素是一種主要由白色脂肪組織分泌的244 個氨基酸的蛋白質，參與糖代謝和脂肪代謝，具有改善胰島素抵抗、抗炎、抗動脈粥樣硬化等作用。體內的循環脂聯素水平還與患惡性腫瘤呈負相關，相關Meta 分析結果提示脂聯素在結直腸癌及腺瘤患者中的水平低于正常健康人[2-4]。Sugiyamai 等[5]通過分子生物學實驗證實脂聯素通過活化磷酸腺苷活化的蛋白激酶（AMPK），進而下調哺乳動物雷帕霉素標靶信號通路（mTOR），從而起到誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期、抑制腫瘤細胞生長的作用。以往的研究表明，脂聯素在結直腸癌發生、發展中起到重要的作用[6-8]。脂聯素是否可以通過改善糖代謝、胰島素抵抗等抑制結直腸癌腫瘤生長和轉移目前尚缺乏相關實驗研究。為此，筆者設計本實驗，探討脂聯素對糖尿病相關結直腸癌的影響，分析相關通路變化，以期明確脂聯素對腫瘤抑制的作用靶點和分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和細胞株 4 周齡的雌性糖尿病小鼠（美國B6.V-Lepob/OlaHsd Harlan 實驗室）、小鼠結直腸癌細胞株MCA38（浙江大學腫瘤研究所）。

1.2 主要試劑及設備 小鼠重組脂聯素（北京康肽生物科技有限公司），胰酶、FBS、青霉素、鏈霉素、DMEM培養基（美國Hyclone 公司），細胞恒溫培養箱（上海Healforce 公司），ELISA 試劑盒（美國ALPCO Diagnostics 公司），強生單鍵血糖儀（美國強生公司），TNF-α 試劑盒（上海欣博盛公司，EMC102a.48），IL-6 試劑盒（上海欣博盛公司，EMC004.48），IL-1β 試劑盒（上海欣博盛公司，EMC001b），XDS-500C 型顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司），5702R 型低速離心機（德國Eppendorf公司），Ras 抗體（上海abcam 公司，ab52939），β-actin抗體（美國Proteintech 公司，60008-1-Ig），胰島素生長因子受體-2（IGF-2R）抗體（美國Proteintech 公司，20253-1-AP），c-Myc 抗體（美國Proteintech 公司，10057-1-AP），β-catenin 抗體（美國Proteintech 公司，51067-2-AP），過氧化物酶體增殖劑激活受體抗體γ（PPAR γ）抗體（美國Proteintech 公司，16643-1-AP），p21 活化激酶-1（PAK-1）抗體（美國Proteintech 公司，21401-1-AP），山羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗（上海碧云天公司，A0208），PBS（上海長島抗體診斷試劑公司，FL-2004），過硫酸銨（北京solarbio 公司，A8090），十二烷基硫酸鈉（SDS）（北京solarbio 公司，S8010），Tris（北京solarbio 公司，T8060），Tween-20（美國Amresco 公司，BYL40713），miniprotean3 cell 型電泳儀（上海BIO-RAD 公司）。

1.3 動物分組 將糖尿病小鼠按照隨機數字表法分成以下4 組（每組8 只）：皮下成瘤治療（SA）組：皮下成瘤+小鼠重組脂聯素；皮下成瘤對照（SC）組：皮下成瘤+0.9%氯化鈉溶液；肝轉移治療（LA）組：肝轉移+小鼠重組脂聯素；肝轉移對照（LC）組：肝轉移+0.9%氯化鈉溶液。按組別分別向小鼠腹腔注射小鼠重組脂聯素（5μg/d）或0.9%氯化鈉溶液至脊髓脫臼法處死。

1.4 動物實驗 依據相關研究，通過注射MCA38 細胞構建結直腸癌皮下成瘤、肝轉移模型[9-10]。將小鼠結直腸癌細胞株MCA38 培養在含10%的FBS、100U/ml 的青霉素和100U/ml 的鏈霉素的DMEM 培養基中，并置于37℃、5%CO2的細胞培養箱內。培養至指數生長期（約24h）后，制成單細胞懸液（濃度為5×107/ml）。按組別開始注射7d 后，SA 組、SC 組小鼠前肢腋下皮下注射MCA38 細胞懸液100μl，繼續飼養28d 后處死；LA 組、LC 組小鼠用戊巴比妥鈉麻醉后仰臥固定，皮膚消毒后取左側肋下切口，逐層進腹后暴露脾臟并游離至體腔外，MCA38 細胞懸液100μl 緩慢于脾臟包膜下注入，5min 后結扎脾門并摘除小鼠脾臟，止血后關腹，繼續飼養42d 后處死。

1.5 腫瘤體積及轉移性結節記錄 SA 組、SC 組小鼠待局部成瘤后每隔3d 測量長徑和短徑計算腫瘤體積；LA組、LC 組小鼠處死后取出肝臟，計數轉移性結節個數。

1.6 糖尿病相關指標的檢測 采用ELISA 法。分別在SA 組、SC 組小鼠重組脂聯素或0.9%氯化鈉溶液注射前（第0 天）、皮下腫瘤注射前（第7 天）、腫瘤接種后（第14、21 天）、小鼠處死前（第28 天），或LA 組、LC 組小鼠重組脂聯素或0.9%氯化鈉注射液注射前（第0 天）、皮下腫瘤注射前（第7 天）、腫瘤接種后（第14、21、28、35天）、小鼠處死前（第42 天），小鼠尾靜脈取血，采用血糖儀檢測血糖濃度，檢測前小鼠空腹12h。使用ELISA 試劑盒檢測4 組小鼠處死前血液中糖尿病相關指標脂聯素（adiponectin，ADPN）、瘦素（Leptin）、IGF-1、胰島素（Insulin）濃度的變化。

1.7 炎癥相關標志物水平的檢測 采用ELISA 法。使用Th1/Th29-plex assay 超敏試劑盒測試小鼠處死前血液中炎癥相關標志物TNF-α、IL-6、IL-1β 的濃度變化。

1.8 腫瘤組織病理學檢查及相關通路蛋白水平的檢測 所有小鼠處死后，腫瘤組織部分以10%中性甲醛溶液固定繼續病理切片觀察。采用Western blot 法檢測腫瘤組織中腫瘤相關通路蛋白IGF-2R、Ras、c-Myc、βcatenin、PPAR γ 及PAK-1 表達水平的變化。

1.9 統計學處理 采用SPSS 22.0 統計軟件。計量資料以表示，多組間兩兩比較采用LSD-t法。采用GraphPad Prism 6 軟件對實驗數據進行相關圖片的繪制。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4 組小鼠腫瘤體積及轉移性結節的比較 造模成功后12d 時SA 組、SC 組小鼠腫瘤體積比較差異無統計學意義；而16、20、24、28d 時，SA 組小鼠腫瘤體積均小于SC 組小鼠，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。LA 組小鼠轉移性結節數平均為（5.4 1.34）個，與LC組（2.2 0.84）個比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。肝組織形態見圖1（插頁）。

圖1 肝組織形態（A 為LC 組，B 為LA 組）

表1 不同時間SA 組、SC 組小鼠腫瘤體積的比較（mm3）

2.2 4 組小鼠血糖濃度及ADPN、Leptin、IGF-1 及Insulin 濃度的比較 隨著時間的增加，尤其14d 以后，相比SC 組、LC 組，SA 組和LA 組的小鼠血糖濃度均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖2、3；SA 組和LA 組小鼠ADPN 濃度均明顯升高，Leptin、IGF-1 及Insulin 濃度均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表2。

圖2 不同時間SC 組和SA 組小鼠血糖濃度（與SC 組比較，**P＜0.01）

圖3 不同時間LC 組和LA 組小鼠血糖濃度（與LC 組比較，**P＜0.01）

表2 4 組小鼠ADPN、Leptin、IGF-1 及Insulin 濃度的比較

2.3 4 組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β 濃度的比較 相較于SC 組及LC 組，SA 組、LA 組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β 濃度均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表3。

表3 4 組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β 濃度的比較

2.4 4 組小鼠腫瘤組織病理變化 HE 染色下，SC 組中，腫瘤細胞核大深染，核分裂現象較多，細胞排列緊密、規整；SA 組可見腫瘤細胞有所減少，細胞排列疏松、大小不一，并出現壞死組織，見圖4（插頁）。LC 組中，腫瘤細胞分化差，異型性明顯，胞質少，核大深染且不規則，核分裂象易見；LA 組可見腫瘤細胞減少，核分裂象減少，出現組織壞死情況，見圖5（插頁）。

圖4 腫瘤組織病理變化（a-b:SC 組；c-d:SA 組；HE 染色，×200）

圖5 腫瘤組織病理變化（a-b:LC 組；c-d:LA 組；HE 染色，×200）

2.5 4 組小鼠IGF-2R、Ras、c-Myc、β-catenin、PPAR γ及PAK-1 表達水平的比較 SA 組、LA 組小鼠IGF-2R、Ras、c-Myc、β-catenin、PPARγ 及PAK-1 表達水平較SC 組及LC 組均下調，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖6、7、8。

圖6 各組基因蛋白表達電泳圖（A：SC 組；B：SA 組；C：LC 組；D：LA 組）

圖7 SC 組與SA 組腫瘤相關通路蛋白表達的比較（與SC 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

圖8 LC 組與LA 組腫瘤相關通路蛋白表達的比較（與LC 組比較，*P＜0.05）

3 討論

結直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，隨著化療藥物、靶向治療藥物的進步和多學科協作治療的發展，使得療效有了明顯的提高，但腫瘤的侵襲和轉移仍是治療失敗的主要原因[11]。結直腸癌在所有惡性腫瘤中發病數居第3 位，死亡數亦高居第3 位[12]。流行病學研究表明，糖尿病患者發生乳腺癌、肝癌、胰腺癌、結腸癌等惡性腫瘤的風險明顯高于正常人。相較于普通人群，2 型糖尿病患者罹患結直腸癌的風險增加了高達3 倍[13]。高胰島素血癥和胰島素樣生長因子-1（IGF-1）在結腸細胞代謝、細胞生長、增殖和調節細胞凋亡等過程中發揮了重要作用[14-16]。胰島素水平和IGF-1 水平的升高可激活Ras 信號途徑，促進結腸細胞的增殖，導致一種生存優勢，從而誘發結直腸癌的發生[17]。

脂聯素是近年發現的一種主要由白色脂肪組織分泌的重要因子，參與糖代謝和脂肪代謝，能改善胰島素抵抗。Awazawa 等[18]發現脂聯素可通過IL-6 依賴的方式激活信號轉導及轉錄活化因子3，上調肝臟胰島素受體底物2 的表達，增強胰島素敏感性?，F有研究顯示脂聯素在腫瘤的發生發展中也起著重要作用，主要通過以下機制發揮抗腫瘤作用：首先，它可以通過刺激受體介導的信號傳導通路直接作用于癌細胞，如AMPK，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K / AKt)。其次，它可以通過調節靶部位的胰島素敏感性，調節炎癥反應和影響腫瘤血管生成來間接起作用[19-20]。本實驗中通過動物實驗，探討脂聯素對糖尿病相關結直腸癌的影響，分析相關通路變化，明確脂聯素對腫瘤抑制的作用靶點和分子機制。本實驗結果表明在糖尿病小鼠中，脂聯素能夠抑制瘤體的生長，對癌細胞的轉移有一定抑制作用。通過比較有無脂聯素作用小鼠的血糖濃度、糖尿病相關標志物、炎癥相關標志物、病理變化及腫瘤相關通路蛋白的變化，提示了脂聯素能通過降低血糖，上調糖尿病相關標志物ADPN 濃度和降低Leptin、IGF-1 及Insulin 濃度，降低炎癥相關標志物TNF-α、IL-6、IL-1β濃度，下調腫瘤相關通路蛋白IGF-2R、Ras、c-Myc、βcatenin、PPAR γ 及PAK-1 的表達從而影響腫瘤的生長和轉移。

綜上所述，本研究表明脂聯素能抑制糖尿病相關結直腸癌的生長和轉移，主要機制可能與降低Leptin、IGF-1、Insulin 濃度以改善胰島素抵抗，降低血糖，降低炎癥相關標志物TNF-α、IL-6、IL-1β 的濃度，下調腫瘤相關通路蛋白IGF-2R、Ras、c-Myc、β-catenin、PPAR γ及PAK-1 的表達有關。