血管抑素對翼狀胬肉細胞增殖及MMP- 9、TIMP- 1、VEGF 水平的影響

金偉平 林鳴國

翼狀胬肉是最常見的眼結(jié)膜病變，其特點為瞼裂部球結(jié)膜血管組織增生并向角膜浸入，其突出的病理特征為變性，具有比較高的復(fù)發(fā)率，當(dāng)胬肉組織不斷增長時，可產(chǎn)生刺激癥狀，影響患者面容，甚至引起視力下降[1]。不斷侵襲和纖維血管組織增殖是翼狀胬肉形成的基礎(chǔ)，角膜緣屏障和細胞間基質(zhì)屏障的破壞可能是翼狀胬肉進展的主要原因[2]。基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）為基質(zhì)金屬蛋白家族主要成員，可降解細胞外基質(zhì)，參與翼狀胬肉的發(fā)生和發(fā)展。而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP1）可抑制MMP-9 的活性，防止細胞外組織屏障被破壞[3]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是高度特異的血管內(nèi)皮細胞有絲分裂素，可誘導(dǎo)血管形成，參與翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展[4]。血管抑素具有極強的新生血管生成抑制作用[5]，對惡性腫瘤的增殖、侵襲遷移具有抑制作用。本文對血管抑素對翼狀胬肉細胞增殖及MMP-9、TIMP-1、VEGF 水平的影響進行研究，為翼狀胬肉的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源 翼狀胬肉組織標(biāo)本來自2015 年3 月至2016 年3 月舟山醫(yī)院眼科中心手術(shù)切除的150 例初發(fā)翼狀胬肉患者，正常結(jié)膜組織來自同期150 例視網(wǎng)膜脫離患者手術(shù)中切除的正常結(jié)膜組織。

1.2 手術(shù)方法翼狀胬肉患者行翼狀胬肉切除術(shù)+自體角膜緣干細胞移植術(shù)，手術(shù)由同一位眼科手術(shù)醫(yī)生完成。患者麻醉成功后，從胬肉頸部剪開球結(jié)膜，分離胬肉組織和球結(jié)膜，從胬肉頭部剝離至角膜緣，鈍性分離胬肉體部至根部，剪除胬肉組織。在上方角膜緣分離球結(jié)膜組織至角膜緣內(nèi)側(cè)1mm 左右處，剪下薄層球結(jié)膜植片，將球結(jié)膜植片移至鞏膜暴露區(qū)，縫合并固定植片。

1.3 主要試劑 D-Hanks 液、FBS、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、accutase 酶、四唑鹽（MTT）、二甲基亞砜購自美國Sigma 公司，Trizol 試劑盒、RT-PCR 試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒均購自美國CST 公司；MMP-9、TIMP-1、VEGF 引物均購自上海天根生化科技有限公司設(shè)計并合成，瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集（RIPA）裂解液，β-actin 抗體、辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG 抗體、兔抗人MMP-9 多克隆抗體、兔抗人TIMP-1 多克隆抗體、兔抗人VEGF 多克隆抗體購自美國Gibco 公司，電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒購自美國Sigma 公司。

1.4 翼狀胬肉細胞和正常結(jié)膜細胞培養(yǎng) 翼狀胬肉細胞培養(yǎng)及鑒定：將手術(shù)切除的初發(fā)翼狀胬肉組織標(biāo)本浸潤到D-Hanks 液中，采用組織塊培養(yǎng)法，用含小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)至原代貼壁細胞基本鋪滿瓶底時，用胰蛋白酶消化，以1∶2 的比例繼續(xù)傳代培養(yǎng)，取第3 代細胞，用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物法對抗波形蛋白免疫細胞進行化學(xué)染色，鑒定翼狀胬肉細胞，鑒定后翼狀胬肉細胞用于后續(xù)實驗。正常結(jié)膜細胞培養(yǎng)及鑒定：采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)正常結(jié)膜細胞，待細胞爬壁后，將組織塊取出，將爬壁細胞離心，常規(guī)培養(yǎng)，按照1:2 比例傳代，對細胞進行抗增殖細胞核抗原抗體和角蛋白熒光標(biāo)記鑒定為人正常結(jié)膜細胞。

1.5 細胞分組情況 將每例翼狀胬肉組織分離的翼狀胬肉細胞均分為胬肉對照組150 例和血管抑素組150例，并設(shè)正常結(jié)膜細胞為正常對照組150 例，胬肉對照組和正常對照組用空白對照培養(yǎng)基培養(yǎng)，血管抑素組用含50ml/L 血管抑素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.6 血管抑素組和胬肉對照組翼狀胬肉細胞增殖情況測定 采用MTT 比色法。取上述培養(yǎng)的第3 代翼狀胬肉細胞，胰蛋白酶消化后制成翼狀胬肉細胞單細胞懸液，置離心管中離心（1 000r/min）2min，去上清液，加入accutase 酶消化，離心（1 000r/min）2min，加入培養(yǎng)基吹打均勻后制成單細胞懸液。胬肉對照組和血管抑素組各自培養(yǎng)48h 后，調(diào)整兩組翼狀胬肉細胞濃度為1×104/ml，接種到96 孔板中，分別在0、24、48、72h 取出96 孔板加入20μl MTT 溶液（5mg/ml）孵育4h，酶標(biāo)儀測定波長490nm 的吸光度值。

1.7 各組細胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF mRNA 表達水平測定 采用RT-PCR 法。取上述培養(yǎng)的第3 代翼狀胬肉細胞，3 組細胞各自培養(yǎng)48h 后，加入Trizol 裂解液裂解細胞，提取細胞總RNA，根據(jù)RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR 法測定翼狀胬肉細胞中MMP-9（上游引物：5′-GACTCGGTGTTTGATGAGCC-3′，下游引物為：5′-GAACTCAGACGCCAGTACAA-3′）、TIMP-1（上游引物：5′-CAGAA CCCCAGGGACGAG-3′，下游引物為：5′-CCCAGAGAACCAGGCAGC-3′）、VEGF（上游引物：5′-TGGACGCTGGCTTGACTGCTG-3′，下游引物為：5′-GGCAACAGCTGCGCTGTACA-3′）mRNA 水平，RTPCR 反 應(yīng) 條 件 為：95℃10s、95℃30s、56℃15s、60℃60s，72℃30s，共40 個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示翼狀胬肉細胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF mRNA 表達水平。

1.8 各組翼狀胬肉細胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF 蛋白表達水平測定 采用Western blot 法。取上述培養(yǎng)的第3 代翼狀胬肉細胞，各組細胞培養(yǎng)48h 后，加入RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度。將蛋白進行電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉，加入一抗過夜孵育，以β-actin 為內(nèi)參照，加入二抗孵育2h，ECL 顯影拍照，BioRad 圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值，目標(biāo)蛋白表達水平以目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值表示。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，血管抑素組和胬肉對照組翼狀胬肉細胞不同時點吸光度值比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析；3 組間MMP-9 等指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。胬肉對照組翼狀胬肉細胞中MMP-9、TIMP-1 與VEGF 的相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血管抑素組和胬肉對照組翼狀胬肉吸光度值比較血管抑素組和胬肉對照組不同時點翼狀胬肉細胞吸光度值比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=477.922、3496.405，均P＜0.01）。不同時點血管抑素組翼狀胬肉細胞吸光度值均低于胬肉對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。見表1。

表1 血管抑素組和胬肉對照組各時點翼狀胬肉細胞吸光度值比較

2.2 3 組細胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF mRNA 表達水平比較 血管抑素組和胬肉對照組MMP-9、TIMP-1、VEGF mRNA 表達水平均高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而血管抑素組MMP-9、TIMP-1、VEGF mRNA 表達水平均低于胬肉對照組，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

2.3 3 組細胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF 蛋白表達水平比較 血管抑素組和胬肉對照組MMP-9、TIMP-1、VEGF 蛋白表達水平均高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而血管抑素組細胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF 蛋白表達水平均低于胬肉對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表3、圖1。

表2 3 組細胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF mRNA 表達水平比較

表3 各組胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF 蛋白表達水平比較

圖1 各組翼狀胬肉細胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF 蛋白電泳圖（A 為正常對照組，B 為胬肉對照組，C 為血管抑素組）

2.4 胬肉對照組翼狀胬肉細胞中MMP-9、TIMP-1 與VEGF mRNA 表達的相關(guān)性 胬肉對照組翼狀胬肉細胞中MMP-9 與VEGF mRNA 的表達呈正相關(guān)（r=0.621，P＜0.01），TIMP-1 與VEGF mRNA 無相關(guān)性（r=0.079，P＞0.05）。

2.5 胬肉對照組翼狀胬肉細胞中MMP-9、TIMP-1 與VEGF 蛋白表達的相關(guān)性 胬肉對照組翼狀胬肉細胞中MMP-9 與VEGF 蛋白的表達呈正相關(guān)（r=0.602，P＜0.01），TIMP-1 與VEGF 蛋白的表達無相關(guān)性（r=0.114，P＞0.05）。

3 討論

翼狀胬肉可侵犯眼角膜引起散光，或遮蓋瞳孔區(qū)引起視力下降[6]，嚴重者造成視力損害，影響患者的身心健康，應(yīng)引起大家廣泛重視[7]。翼狀胬肉的發(fā)病機制比較復(fù)雜，以往認為翼狀胬肉是一種變性性、增生性疾病，近年來研究發(fā)現(xiàn)增生是翼狀胬肉的主要特點[8]。研究發(fā)現(xiàn)血管抑素對細胞增殖具有明顯的抑制作用，本研究發(fā)現(xiàn)血管抑素對翼狀胬肉細胞的增殖具有明顯的抑制作用，表明血管抑素可能通過抑制翼狀胬肉細胞增殖從而抑制翼狀胬肉的發(fā)生、發(fā)展。

MMPs 在翼狀胬肉的發(fā)病中具有重要作用，MMPs家族成員可溶解細胞間的半橋粒連接，增強翼狀胬肉細胞的移行性，引起翼狀胬肉細胞向各個方向離心性移動至角膜、結(jié)膜、角鞏膜緣的基底膜上，浸入角膜的翼狀胬肉細胞不斷表達MMPs，破壞角膜前彈力層，引起角膜損傷[9]。MMP-9 是MMPs 家族主要成員，具有降解和重塑細胞外基質(zhì)的功能[10]，在正常對照組織中，MMP-9 可通過分解和重塑細胞外基質(zhì)實現(xiàn)對細胞外基質(zhì)的重建，還可調(diào)控其它蛋白酶、炎癥介質(zhì)和細胞因子的活性[11]；MMP-9 對VEGF 具有調(diào)控作用，從而調(diào)控新生血管的生成[12]。TIMP-1 為多功能的分子，可抑制MMPs 的活性，抑制血管生成、刺激皮質(zhì)類固醇的生成[13]。VEGF 可增強血管內(nèi)皮細胞有絲分裂，通過特異性受體作用于血管內(nèi)皮細胞，促進血管內(nèi)皮細胞分化、趨化作用和內(nèi)皮細胞的遷移和增殖，可增強血管的通透性，促進基質(zhì)細胞和新生血管生長，在翼狀胬肉組織中VEGF 水平升高，VEGF 參與翼狀胬肉的發(fā)生、發(fā)展[14-15]。翼狀胬肉發(fā)病中纖維血管增殖和侵襲是其發(fā)病的基礎(chǔ)，介于MMP-9、TIMP-1、VEGF 在細胞外基質(zhì)動態(tài)平衡和血管生成方面發(fā)揮重要作用，李盈龍等[16]研究發(fā)現(xiàn)MMP-9 可通過促進VEGF 的產(chǎn)生、破壞細胞外基質(zhì)屏障從而在翼狀胬肉的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。由此推測抑制MMP-9和VEGF 可抑制翼狀胬肉的發(fā)生、發(fā)展。

血管抑素是最強有力的新生血管生成抑制劑，可抑制纖溶酶原活性，造成細胞侵犯活性下降[17]；可通過調(diào)節(jié)纖溶酶的形成，影響細胞的遷移和侵犯能力；通過抑制血管內(nèi)皮細胞的增生抑制新生血管形成，血管抑素直接作用于增殖狀態(tài)的血管內(nèi)皮細胞，對其他細胞及正常狀態(tài)的內(nèi)皮細胞沒有抑制作用；血管抑素還可破壞已經(jīng)建立的新生血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而抑制新生血管形成[18]。介于血管抑素具有影響細胞侵襲和侵犯能力，以及強有力的抑制血管形成作用，而MMP-9、TIMP-1、VEGF 在翼狀胬肉發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，由此推測血管抑素可能通過抑制MMP-9、TIMP-1、VEGF 抑制翼狀胬肉的發(fā)生、發(fā)展。本文對其進行研究發(fā)現(xiàn)與正常細胞比較，翼狀胬肉細胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF 表達水平升高，MMP-9 與VEGF 表達水平呈正相關(guān)；血管抑素可抑制翼狀胬肉細胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF 表達水平。分析血管抑素對翼狀胬肉的發(fā)生、發(fā)展具有抑制作用，其機制可能為翼狀胬肉發(fā)病過程中，MMP-9 表達水平升高，為了維持細胞外基質(zhì)平衡，TIMP-1 表達水平也相應(yīng)升高，當(dāng)MMP-9 升高速度高于TIMP-1 升高速度時導(dǎo)致翼狀胬肉的生長；翼狀胬肉是VEGF 表達水平也升高，促進新生血管的形成，在翼狀胬肉發(fā)生中發(fā)揮作用，MMP-9 水平與VEGF 水平呈正相關(guān)表明MMP-9 除了可破壞細胞外基質(zhì)外，還可能通過促進VEGF 生成促進翼狀胬肉的發(fā)生。血管抑素可能通過抑制翼狀胬肉細胞中MMP-9、TIMP-1、VEGF 水平抑制翼狀胬肉血管形成抑制翼狀胬肉的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，血管抑素可能通過抑制翼狀胬肉細胞增殖和翼狀胬肉血管生成抑制翼狀胬肉生長的作用，血管抑素有望為翼狀胬肉的治療提供新的思路。