雷公藤內酯醇對肺癌荷瘤小鼠髓系抑制性細胞的影響及機制研究

孫蕾 趙嘉璐 藍秀 呂祝慶 黎媛 李偉文

研究表明雷公藤內酯醇具有顯著的抗腫瘤作用，其抗肺癌作用與誘導細胞凋亡、細胞周期阻滯有關。雷公藤內酯醇可通過微小RNA-21 促進第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物基因表達，誘發肺癌細胞凋亡[1]。雷公藤內酯醇及其衍生物可激活p53-沉默調節蛋白3 途徑從而誘發線粒體功能損傷，抑制肺癌細胞增殖[2]。在人源肺癌異種移植模型中證實雷公藤內酯醇衍生物通過抑制無翅型乳腺癌病毒整合位點家族成員1通路來促進細胞凋亡，并降低細胞的遷移和侵襲能力，防止肺癌轉移[3]。雷公藤內酯醇還能通過抑制絲裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B 信號通路來增加耐藥性肺癌A549 細胞對化療藥物的敏感性，促進細胞凋亡，誘導細胞周期阻滯[4]。然而雷公藤內酯醇對肺癌腫瘤免疫的影響及機制仍未完全明確。本研究將通過多種方法觀察雷公藤內酯醇對肺癌A549 細胞荷瘤小鼠髓系抑制性細胞（MDSC）的影響，并探討其潛在的分子機制，為雷公藤內酯醇治療肺癌提供科學根據。

1 材料和方法

1.1 材料 主要試劑：雷公藤內酯醇（純度≥98%，批號:38748-32-2，粉劑，50mg/支）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，4-苯基丁酸鈉（4-PBA，批號：S4125，粉劑，50mg/支）購美國自賽萊克化學公司；β-肌動蛋白（β-actin）、B 淋巴細胞瘤-2 基因（Bcl-2）、B 淋巴細胞瘤-2 基因相關X（Bax）、CCAAT-增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）、內質網應激相關分子葡萄糖調節蛋白-78（GRP78）和蛋白激酶R 樣內質網激酶（PERK）單克隆抗體均購自美國細胞信號技術公司；CD16/CD32（批號：16-0161-82）、PE-Cy5-Gr-1（批號：15-5931-81）、FITCCD11b（批號：11-0112-41）抗體均購自美國英杰生命技術有限公司；RT-qPCR 相關試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。細胞：肺癌A549 細胞購自上海生命科學細胞庫。6～8 周齡、體重（20.1±2.3）g 的C57BL/6 小鼠購自溫州醫科大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（浙）2015-009。

1.2 細胞培養與細胞懸液配制 肺癌A549 細胞用含10FBS、100U/ml 青霉素、100μg/ml 鏈霉素的杜爾伯科改良伊格爾培養基培養，接種于培養皿后，置入37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中培養，取對數生長期細胞，在無菌條件下，用0.25%胰酶消化后，收集懸浮A549細胞，經細胞計數，用PBS 調整細胞密度為5×106個/ml，備用。

1.3 小鼠飼養及肺癌移植瘤模型建立 按照文獻[5]中的方法，所有小鼠均置于室溫（22.1±2.0）℃的環境中飼養，并設置12h 晝夜交替節律。經異氟烷吸入性麻醉后，用1ml 注射器抽取PBS 配制的5×106個A549 細胞，注入小鼠右前肢皮下，建立肺癌移植瘤模型。

1.4 分組與給藥 接種7d 后，用游標卡尺測量腫瘤大小，并計算腫瘤體積，取腫瘤體積約50mm3的小鼠進行試驗。按照隨機數字表法將荷瘤小鼠分為對照組、雷公藤內酯醇組、4-PBA 組和4-PBA+雷公藤內酯醇組4組，每組8 只。雷公藤內酯醇組每日腹腔注射0.2ml（濃度為1μg/ml）雷公藤內酯醇+0.4ml 0.9%氯化鈉注射液，4-PBA 組每日腹腔注射0.4ml（濃度為100μg/ml）4-PBA+0.2ml 0.9%氯化鈉注射液，4-PBA+雷公藤內酯醇組每日注射0.2ml 雷公藤內酯醇和0.4ml 4-PBA，對照組給予腹腔注射等量的0.9%氯化鈉注射液。所有小鼠每周監測腫瘤體積，于第21 天后采用斷頭法處死所有小鼠，剝下腫瘤組織，測量腫瘤體積和質量。

1.5 MDSC 比例檢測 采用流式細胞術。按照文獻[6]中的方法，處死荷瘤小鼠后，切開腹腔取出脾臟，置于含有1 000U/ml 青霉素、1 000U/ml 鏈霉素的PBS 中，經研磨、過濾、離心后收集細胞懸液，加入紅細胞裂解液5ml，靜置5min，再用PBS 稀釋，以1 500r/min 離心5min，重復2 次，制成單細胞懸液。經計數，調整細胞濃度為5×106個/ml。取100μl 加入離心管中，加入CD16/CD32抗體，經PBS 洗滌2 次后，依次加入2μl PE-Cy5-Gr-1和2μl FITC-CD11b 抗體，避光孵育20min，上機檢測。

1.6 重組人精氨酸酶1（ARG1）、一氧化氮合酶（iNOS）mRNA 表達檢測 采用RT-qPCR 法。Trizol 法提取MDSC 總RNA，按照Takara 反轉錄試劑盒說明書步驟合成cDNA，接著進行按照SYBR Green 方法進行qPCR，反應體系 為25μl，采用2-ΔΔCt法分析ARG1 和iNOS mRNA 的表達量。使用GAPDH 作為內參照，引物系列如下：ARG1：正向5′-CCAGAAGAATGGAAGAGTCAGTGT-3′，反向5′-GCAGATATGCAGGGAGTCACC-3′；iNOS：正向5′-CACCAAGCTGAACTTGAGCG-3′，反向5′-CGTGGCTTTGGGCTCCTC-3′；GAPDH：正向5′-GACTTCAACAGCAACTCCCAC-3′，反向5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.7 MDSC 凋亡檢測 采用流式細胞術。將荷瘤小鼠脾臟細胞懸液置于EP 管中，分別加入PE-Cy5-Gr-1 和FITC-CD11b 抗體，避光孵育20min，經PBS 洗滌2 次后，制成單細胞懸液，用Moflo XDP 超速流式細胞分選CD11b+Gr-1+細胞，置于含有10%FBS 的培養基中。取上述MDSC 細胞懸液，經計數，調整細胞數量為1×106/ml，離心并棄細胞上清液，加入500 μl 結合緩沖液，輕輕重懸細胞，依次加入5μl 膜聯蛋白V 和5μl 碘化丙啶，輕輕混勻，室溫下避光孵育15 min，上機檢測。

1.8 Bcl-2、Bax、CHOP、GRP78 和PERK 表達檢測 采用Western blot 法。取5×106個MDSC 細胞，加入細胞裂解液冰上裂解15min，12 000r/min 離心15min，吸取上清液。經二喹啉甲酸法定量后，取20μg 總蛋白4%～12%聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分離，電轉至聚偏氟乙烯膜上，3%脫脂牛奶室溫封閉1h。加入一抗4℃孵育過夜，隨后磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）緩沖液洗PVDF 膜3次，每次8 min，加入辣根過氧化物酶標記的第二抗體室溫孵育1～2 h，再用PBST 緩沖液洗PVDF 膜3 次，每次8 min，增強化學發光試劑發光、顯影和定影。并用image J 分析。

1.9 統計學處理 采用SPSS 22.0 統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4 組小鼠腫瘤體積和腫瘤質量的比較 與對照組相比，雷公藤內酯醇組和4-PBA+雷公藤內酯醇組在第21 天時腫瘤體積、腫瘤質量明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與雷公藤組相比，4-PBA 組和4-PBA+雷公藤內酯醇組腫瘤體積、腫瘤質量均明顯增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與4-PBA 組相比，4-PBA+雷公藤內酯醇組腫瘤體積、腫瘤重量均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表1。

2.2 4 組小鼠MDSC 比例及ARG1、iNOS mRNA 表達的比較 與對照組相比，雷公藤內酯醇組在第21 天時MDSC 比例和ARG1、iNOS mRNA 表達均明顯下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與雷公藤內酯醇組相比，4-PBA 組和4-PBA+雷公藤內酯醇組MDSC 比例和ARG1、iNOS mRNA 表達均明顯增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與4-PBA 組相比，4-PBA+雷公藤內酯醇組MDSC 比例和ARG1、iNOS mRNA 表達比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表2。

表1 4 組小鼠腫瘤體積和腫瘤質量的比較

表2 4 組小鼠MDSC 比例及ARG1、iNOS mRNA 表達的比較

2.3 4 組小鼠MDSC 凋亡率及Bcl-2、Bax 表達的比較 與對照組相比，雷公藤內酯醇組在第21 天時MDSC 凋亡比例增加，Bcl-2 表達下降，Bax 表達增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與雷公藤內酯醇組相比，4-PBA 組和4-PBA+雷公藤內酯醇組MDSC 凋亡比例下降，Bcl-2 表達增加，Bax 表達下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與4-PBA 組相比，4-PBA+雷公藤內酯醇組MDSC 凋亡、Bcl-2、Bax 表達比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見圖1、表3。

圖1 4 組小鼠Bcl-2、Bax 表達的電泳圖

2.4 4 組小鼠MDSC CHOP、GRP78 和PERK 表達的比較 與對照組相比，雷公藤內酯醇組在第21 天時CHOP、GRP78 和PERK 表達均明顯增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與雷公藤內酯醇組相比，4-PBA 組和4-PBA+雷公藤內酯醇組CHOP、GRP78 和PERK 表達均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與4-PBA 組相比，4-PBA+雷公藤內酯醇組CHOP、GRP78 和PERK表達比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見圖2 和表4。

表3 4 組小鼠MDSC 凋亡率及Bcl-2、Bax 表達的比較

圖2 4 組小鼠MDSC CHOP、GRP78 和PERK 表達的電泳圖

表4 4 組小鼠MDSC CHOP、GRP78 和PERK 表達的比較

3 討論

雷公藤內酯醇是雷公藤發揮抗癌活性的重要成分之一[7-8]。近年來，研究證實雷公藤內酯醇的抗癌作用與其免疫調節作用有關。Tu 等[9]發現雷公藤能內酯醇的抗黑色素瘤作用與其能促進固有免疫應答有關。Hu 等[10]證實雷公藤內酯醇能顯著增加卵巢癌移植瘤血清中炎癥因子IL-2 和TIVF-α 的表達以及自然殺傷細胞細胞相關蛋白CD16 和CD56 的表達水平，提示雷公藤內酯醇的抗卵巢癌作用與其免疫調節有關。Chan 等[11]發現雷公藤內酯醇能夠增加白血病小鼠T 細胞、B 細胞、單核細胞和巨噬細胞的數量，并促進巨噬細胞的吞噬功能。上述研究均說明了雷公藤內酯醇的抗癌作用與腫瘤免疫應答密切相關。

MDSC 是不同階段髓系前體細胞分化受阻從而停留在各個分化階段末的成熟粒細胞、巨噬細胞。在腫瘤微環境中，MDSC 分泌大量的的細胞因子（如iNOS、ARG1、轉化生長因子-β、IL-10、前列腺素E2）抑制T 細胞免疫應答和固有免疫反應發揮免疫逃逸作用[12]。研究證實MDSC 與肺癌預后和治療效果密切相關，有效解除MDSC 的免疫抑制作用有利于提高抗肺癌藥物治療效果[13]。因此，找到誘導抑制MDSC 的藥物或者治療手段從而提高肺癌治療效果具有重要意義。本研究中，筆者發現雷公藤內酯醇可顯著降低A549 肺癌荷瘤腫瘤體積和腫瘤質量，進一步證實了雷公藤內酯酮的抗肺癌作用，并且筆者還發現荷瘤小鼠經雷公藤內酯醇治療后脾臟源性MDSC 比例降低，ARG1 和iNOS 表達水平下降，提示雷公藤內酯醇對肺癌源性MDSC 具有抑制作用，且這可能是雷公藤內酯酮抗癌作用的關鍵原因。

內質網應激是在細胞損傷條件下引起的抵抗性反應，當應激持續或強化時轉而促進細胞凋亡，即內質網應激凋亡途徑。研究證實內質網應激與MDSC 細胞凋亡密切相關[14-16]。內質網應激能夠通過干擾素相關凋亡誘導受體激活DMSC 細胞凋亡，降低荷瘤小鼠MDSC比例[14]。MDSC 中活性氧、脂質沉積均處于較高水平，易于誘發細胞內質網應激的發生[15-16]。因此，內質網應激對MDSC 功能調節具有十分重要的作用。本研究中，筆者發現雷公藤內酯醇能夠增加MDSC 細胞內質網相關蛋白CHOP、GRP78 和PERK 表達的作用，提示雷公藤內酯酮可能通過激活細胞內質網應激發揮抑制MDSC 作用。而且雷公藤內酯酮組細胞凋亡比率較對照組顯著增加，提示雷公藤內酯醇可能激活內質網凋亡途徑促進細胞凋亡。進一步研究發現，4-PBA+雷公藤內酯醇組細胞凋亡比例較雷公藤組顯著降低、腫瘤體積和腫瘤質量顯著增增加，說明內質網應激抑制劑4-PBA 顯著減輕了雷公藤內酯醇誘發MDSC 細胞凋亡和抑制腫瘤生長的作用。然而，與4-PBA 組相比，4-PBA+雷公藤內酯醇組腫瘤體積、腫瘤質量明顯下降，MDSC 細胞凋亡比例、ARG1、iNOS、CHOP、GRP78 和PERK 的表達均無增加，提示雷公藤內酯醇除了激活MDSC 內質網途徑發揮抗腫瘤的分子機制外，還可能通過其他分子機制，值得進一步探索研究。

總之，本研究證實了雷公藤內酯醇能夠通過激活MDSC 細胞的內質網應激，增加MDSC 凋亡，降低其免疫抑制活性，從而發揮抗腫瘤作用。