鹿瓜多肽及骨髓基質干細胞經股動脈注入治療骨折不愈合的實驗研究

蔡俊 鄭光磊 沈曉強 顧曉民

高能量損傷患者骨折程度常較嚴重，且多伴有骨質缺損，容易發生骨折不愈合（約占長骨骨折的5%～10%[1-2]）。骨折不愈合具有病程長、需多次手術和常發生骨畸形等特點，臨床治療有一定難度，治療方法也多種多樣，但療效和安全性褒貶不一。為此，本研究通過建立新西蘭兔骨折不愈合模型，然后經股動脈注入鹿瓜多肽和轉染的熒光骨髓基質干細胞（bone marrow stromal cell, BMSC）混合液，觀察其治療骨折不愈合的療效和安全性，并探討其機制，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 普通級新西蘭兔[杭州師范大學醫學實驗動物中心，許可證號：SYXK（浙）2016-0014]，FBS（德國PAN 公司），鹿瓜多肽（哈爾濱譽衡制藥有限公司，4ml/支，批號：1602629），兔BMSC 和慢病毒（美國賽業生物公司，1×106/管，病毒顆粒≥1×108/TU，批號：VB150915-10026），堿性磷酸酶試劑盒（德國德賽公司），骨鈣素試劑盒（德國Roche 公司），倒置相差顯微鏡（日本Nikon Ti-E 公司）,熒光顯微鏡（德國Leica DMi8 公司），全自動生化儀（美國Beckman-Coilter AU5800 公司）和全自動免疫分析儀（德國Roche E602 公司）。本實驗嚴格遵守實驗動物福利準則。

1.2 方法

1.2.1 造模 選取21 只健康雄性新西蘭兔，體重（2.5±0.5）kg，所有實驗動物均單獨飼養，每只兔均選取左后肢用于實驗。無菌原則下全身麻醉后，聚維酮碘消毒左后肢。暴露股骨后鋸斷股骨，造成橫行骨折，將骨折端切除0.5cm，剝除骨折遠近端約0.5cm 骨膜，然后使用直徑1.5～2.0mm 克氏針固定，造成骨折不愈合模型。常規飼養，術后應用抗生素預防感染。

1.2.2 分組及用藥 將21 只新西蘭兔按隨機數字表法分為對照組（A 組）、穿刺組（B 組）、經股動脈組（C 組）3組，每組7 只。A、C 組骨折不愈合模型建立同時于同側股動脈插入留置針導管并引出體外。再通過留置導管注入對比劑，確認股動脈及分支通暢情況。兔BMSC 溶液經慢病毒轉染制成顯綠色熒光的BMSC 后，與鹿瓜多肽注射液混合應用。A 組：首次于手術結束時通過股動脈導管注入0.9%氯化鈉注射液10ml，術后再每周1 次，共7 次；B 組：首次于手術結束時經皮穿刺直接在骨折端注入鹿瓜多肽注射液（0.5ml/kg）及轉染的熒光BMSC（1×106個細胞，0.5ml）混合液，用0.9%氯化鈉注射液稀釋至10ml，術后再每周1 次，共7 次；C 組：首次于手術結束時通過股動脈導管注入同B 組的混合液，術后再每周1 次，共7 次。

1.2.3 骨痂X 線檢查與Nordsletten 評分 術后第1、4、7 周攝X 線片，觀察骨痂生成、骨折愈合情況，以X 線片可見骨癡通過骨折線且骨折線接近消失作為骨折愈合判定標準，由2 位有工作經驗的放射學醫師按照骨痂Nordsletten 評分標準[3]進行獨立評價：0 級：無骨痂；1級：僅見少量骨痂；2 級：骨痂量正常；3 級：骨痂量過度。

1.2.4 堿性磷酸酶（ALP）和骨鈣素（OCN）水平測定分別采用免疫發光法和電化學發光法。術后第1、4、7 周抽取耳緣靜脈血5ml 離心后取上清液，分別應用全自動生化儀和全自動免疫分析儀行ALP 和OCN 水平檢測。

1.2.5 熒光細胞觀測和分析 第7 周給藥后第2 天處死動物，截取股骨骨折遠近端1.5cm 骨質，用高糖DMEM 培養基溶液反復沖洗骨質，吹洗出其中的BMSC，經離心后接種于培養皿中，在熒光顯微鏡200 倍條件下觀察轉染的熒光BMSC 的形態和聚集情況，并對同一視野用倒置相差顯微鏡100 倍條件下觀察所有BMSC。用MATLAB 圖像分析軟件在200 倍條件下對A、B、C 組的熒光圖像進行處理，以未轉染組熒光圖像的背景基礎亮度為最低閾值，比較B、C 兩組熒光細胞所占面積（△S），并以此面積占圖像總面積（S）的百分數即△S / S 比值（%）進行統計學分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS 18.0 統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組新西蘭兔骨痂X 線檢查結果和Nordsletten 評分比較 術后A 組第1 周無骨痂生成，第4 周骨折近端少量骨痂生成，骨折移位，第7 周少量骨痂反而部分吸收，骨折線清晰，骨折不愈合模型確立；B 組第1 周可見骨折端外側少量骨痂生成，第4 周外側可見明顯骨痂生成，包裹骨折端，內側骨痂未見生成，骨折線清晰，第7 周骨折端外側骨痂生成明顯，內側骨痂少量生成，骨折線基本消失；C 組第1 周可見骨折端內側少量骨痂生成，第4 周內外側可見較多骨痂生成，包裹骨折端，尤以內側骨痂生成明顯，骨折線不清，第7 周骨折端內外側明顯骨痂生成，骨折線消失，骨折塑形良好，見圖1。C組骨痂Nordsletten 評分不同時間點均高于A 組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；C 組骨痂Nordsletten 評分第1 周和B 組比較差異無統計學意義（P＞0.05），第4、7 周則均明顯高于B 組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

圖1 3 組新西蘭兔術后骨痂X 線檢查結果（a:A 組第1、4、7 周；b:B 組第1、4、7 周；c:C 組第1、4、7 周）

表1 3 組新西蘭兔骨痂Nordsletten 評分比較（分）

2.2 3 組新西蘭兔ALP 和OCN 水平比較 術后C 組第1、4、7 周血清ALP 水平均較A 組和B 組均有明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），各組第7 周ALP水平反而比第4 周減少；C 組術后第1、4、7 周血清OCN水平較A 組和B 組明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2、3。

表2 3 組新西蘭兔ALP 水平比較（U/L）

表3 3 組新西蘭兔OCN 水平比較（ng/ml）

2.3 3 組新西蘭兔熒光細胞的形態、聚集情況和△S / S比值比較 B、C 組均可見明顯呈活性狀態顯綠色熒光的BMSC，且C 組可見更多BMSC 聚集，A 組則無熒光細胞可見。同一視野下倒置相差顯微鏡顯示B、C 兩組注入經轉染顯綠色熒光的BMSC 和動物本身BMSC 共同生長良好，形態上無明顯差別，見圖2、3（插頁）。C 組△S/S 比值明顯高于B 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

圖2 C 組熒光細胞顯微鏡下所見（a-b：熒光顯微鏡下所見，×200；c：同一視野下倒置相差顯微鏡所見，×100）

圖3 B 組熒光細胞顯微鏡下所見（a-b：熒光顯微鏡下所見，×200；c：同一視野下倒置相差顯微鏡所見，×100）

表4 兩組新西蘭兔△S/S 比值比較（%）

3 討論

目前臨床上治療骨折不愈合的方法以內、外固定加植骨手術為主[4-7]，但新的方法如含促骨形成基因的腺病毒載體療法和低強度脈沖超聲技術也在不斷涌現[8-9]。然而，由于自體供骨來源有限，供體部位手術創傷大，易發生感染、疼痛等并發癥，極大地限制了這些技術的應用。BMSC 在體內不僅可以增殖并向成骨細胞轉化，直接參與骨折的修復，而且成骨細胞分泌的一些細胞因子也為修復提供了微環境，加速骨折的修復，其應用為臨床上治療骨折不愈合提供了一種新的方法[10-11]。國外學者的研究顯示在內固定同時接受BMSC 植入是一種安全有效的治療方法，患者術后影像學檢查表現出骨痂生成更快，而骨痂早期生成能極大地改善患者的運動功能[10-11]。國內童培建等[12-13]經皮注射或經旋股內外動脈注射BMSC 治療股骨頭壞死，經長期隨訪取得了良好的臨床療效，這一方法有利于恢復股骨頭內血液供應，提高局部成骨能力，促進死骨修復。本研究C 組經股動脈注入鹿瓜多肽和BMSC 混合液后骨痂生成量、ALP 和OCN水平均較A 組、B 組明顯增加，差異有統計學意義，且通過熒光示蹤技術可以觀察到轉染的熒光BMSC 經股動脈注入后能順利到達骨折端并發揮作用，與兔自身BMSC 共存，無一只實驗兔因感染或排斥反應而死亡，該方法操作簡單易行，鹿瓜多肽和BMSC 混合液經血管注入安全性較高，能明顯促進骨折愈合。

目前建立動物骨折不愈合模型方法有截骨法、機械活動法和組織嵌入法等[14-15]。本研究將新西蘭兔骨折端切除0.5cm，并剝除骨折遠近端約0.5cm 骨膜，然后使用克氏針固定，造成骨折不愈合模型，A 組術后第7 周骨折線仍清晰，骨痂量少且出現骨痂吸收情況，達到臨床骨折不愈合標準，表明該方法操作簡單，造模成功。B 組和C 組隨著細胞和藥物干預時間延長，骨痂生成增多，至第7 周骨折線基本消失，但是C 組較B 組骨痂生成量更多，且內外骨痂生成量均明顯，C 組第1、4、7 周骨痂Nordsletten 評分均比A 組、B 組高（僅第1 周與B 組相比差異無統計學意義）。筆者認為原因有：A 組因骨痂生成量少，骨折端不穩定，微動又可影響骨痂生成；B 組需每次透視下穿刺給藥，且范圍局限，在骨折周圍重新建立新生血管需要一定時間；而C 組直接將藥物及細胞注入股動脈，不但短時間內直接作用到骨折受損血管，而且能通過供血動脈和側支循環直接作用于骨折端，促進成骨。這也與C 組在熒光顯微鏡下觀察到更多BMSC 聚集和△S / S 比值更高相一致，表明經股動脈注入鹿瓜多肽及BMSC 更能夠促進骨痂生成，更有效地治療骨折不愈合。

現已證明ALP 是成骨細胞早期分化的特異性標志物之一，參與調節成骨細胞分化，提供骨鹽，利于成骨，其活性越高，說明前成骨細胞向成熟成骨細胞分化越明顯[16-18]。OCN 僅由成骨細胞合成，是成骨細胞分化成熟和骨形成的指標[17-19]。本研究各組術后第7 周ALP 水平反而比第4 周減少，這與ALP 是成骨細胞早期分化因子，而第7 周B 組和C 組已處于骨塑形階段，A 組處于骨不愈合階段有關。OCN 是成骨細胞在基質礦化階段的表達產物，因而各組術后第1、4、7 周血清OCN 水平隨著細胞和藥物作用時間延長而逐漸升高。C 組術后第1、4、7 周ALP 和OCN 水平均較A 組、B 組明顯升高，差異均有統計學意義，這表明經股動脈注入鹿瓜多肽及BMSC 能增強ALP 和OCN 的表達，從而促進成骨細胞分化，有利于骨折愈合，這也在影像學觀察中得到了證明。

BMSC 只有聚集在骨折端才能更有效發揮促成骨細胞分化作用，從而為骨折愈合奠定基礎。B、C 組從截取骨折段吹洗出經慢病毒轉染顯綠色熒光的BMSC 可以直接在熒光顯微鏡下觀測，C 組較B 組BMSC 聚集更多，形態上無明顯差別，都呈單層生長，多為長梭形或類三角形，這與BMSC 正常培養的活性狀態一致。倒置相差顯微鏡下可見注入的熒光BMSC 與兔本身BMSC 共同生長，形態亦無差別，因而具有可比性。用MATLAB圖像軟件分析△S/S 比值，C 組較B 組高，差異有統計學意義。這直接說明經股動脈注入鹿瓜多肽及BMSC 治療骨折不愈合安全有效，BMSC 能夠順利到達骨折端，并與動物本身BMSC 共生，顯示出良好活性狀態，無排斥反應。C 組因為注入的BMSC 聚集到骨折端周圍更多，從而成骨、促進骨折愈合作用更明顯，這與影像學觀察和相關成骨因子指標檢測結果相一致。

鹿瓜多肽注射液可經血管滴注，是骨科常用的一種較為安全的中藥復方制劑，藥理研究表明不僅可以促進成骨細胞分化表達，且能降低骨折局部毛細血管通透性，減少炎性滲出，減輕疼痛，同時還能降低全血黏度和紅細胞聚集程度，改善骨折周圍血液循環，為骨細胞提供一個良好的生長環境[20]。故本研究選用此藥物，結果證明其與BMSC 制成混合液后，BMSC 能保持活性狀態，而且可以協同發揮促骨形成作用。

總之，經股動脈注入鹿瓜多肽及BMSC 治療骨折不愈合操作簡單可行，安全性高，能有效促進骨折愈合，療效確切。但本研究存在樣本量偏少、缺乏硬組織切片觀察等缺點，有待進一步研究驗證。