Axl高表達對裸鼠胃癌細胞皮下成瘤的影響

田苗苗，田祖宏，張慧霞，張 瑩，寧思明，聶勇戰，胡思雋

(第四軍醫大學西京消化病醫院/空軍軍醫大學第一附屬醫院 腫瘤生物學國家重點實驗室，西安 710032)

胃癌是世界第四大腫瘤，全球胃癌致死率位居所有腫瘤第二位，是我國死亡人數最多的惡性腫瘤之一，對人類健康具有很大的威脅[1]。盡管針對胃癌的發生發展已經取得了諸多進展，但是由于胃癌患者的早診率低和多重耐藥等限制，預后仍然較差[2]。胃癌主要治療措施包括手術治療及化療。胃癌化療治療方案中，一類重要的靶點是受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)。

RTKs是一個跨膜激酶蛋白家族，可以通過和配體結合及磷酸化等模式激活下游信號通路進而激活一系列生化反應，參與多種生命活動，包括組織修復和凋亡清除、免疫調控等[3-4]。Axl(Anexelekto)是RTKs的一種，其在不同類型癌癥中均有較高表達，參與調控腫瘤細胞的增殖侵襲和轉移，并且與癌癥的不良預后相關[5-9]。Axl可介導肺癌、乳腺癌、頭頸和食管鱗狀上皮細胞癌等腫瘤的增殖、遷移、轉移及耐藥等[10-12]。Axl信號通路在胃癌組織和細胞系中高表達，可能通過Akt信號通路調控胃癌細胞增殖，然而具體調控機制仍不明確[13]。為了進一步探討Axl與胃癌發生發展之間的關系，本研究著眼于Axl表達量與胃癌之間的關系及Axl高表達對對裸鼠胃癌系皮下成瘤的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雄性BALB/c裸鼠(5 ～ 6周齡，約20 g)購自北京維通利華有限公司[SCXK (京)2016-0011]；飼養于空軍軍醫大學實驗動物中心[SYXK (陜)2014-001]，12 h晝夜交替，溫度保持在23℃ ～ 25℃，相對濕度恒定在40% ～ 60%，自由飲食。實驗分為兩組，每組8只。實驗動物設計符合福利倫理要求，實驗動物福利倫理審批號：20190214，本實驗符合動物實驗的3R原則。

1.1.2 組織樣本

收集第四軍醫大學西京消化病醫院(空軍軍醫大學第一附屬醫院)2008年至2010年間經病理檢查的胃癌和癌旁組織101例，交由上海芯超生物科技有限公司制備為胃癌和癌旁芯片。實驗所用組織均經病人本人和家屬同意，并簽署知情同意書，且經過醫學倫理委員會審批，倫理委員會批件號：KY20192088-F-1。

1.1.3 細胞系

人胃癌細胞SGC-7901細胞購自上海吉凱生物公司。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清購自四季青公司；1640培養基和胰酶購自美國Gibco公司；過表達慢病毒購自上海吉凱生物公司；抗Axl抗體購自美國CST公司；免疫組化用山羊抗兔IgG和DAB顯色試劑盒均購自中杉金橋公司；總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司。激光共聚焦掃描顯微鏡(FLUOVIEW FV10I)購自美國Olympus公司；小動物活體成像儀(Lumina2)購自美國PE公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 高表達Axl細胞的構建

SGC-7901細胞以2×106個/孔密度鋪于六孔板中，過夜貼壁后加入適量具有綠色熒光蛋白(GFP)編碼基因的慢病毒(過表達慢病毒Let-Axl或對照慢病毒Let-Null)，共培養24 h后更換培養基。72 h后加入嘌呤霉素篩選已轉染細胞，熒光顯微鏡觀察同時進行Western blot和定量PCR檢測確定轉染效率。轉染成功可進行細胞傳代和后續研究。

1.3.2 裸鼠皮下成瘤及小動物活體成像

BALB/c裸鼠(6周)16只用于成瘤實驗，將胃癌細胞SGC-7901/Let-Axl和SGC-7901/Let-Null消化后，PBS清洗兩次，去除殘留培養基，將1×106個細胞接種于裸鼠的右側背部皮下，每周觀察裸鼠的狀態、腫瘤的生長狀況[14]。于第二和四周時，對裸鼠進行麻醉后，利用小動物活體成像儀進行荷瘤裸鼠活體成像并拍照(生物發光，激發波長488 nm，發射波長507 nm)[15]。

1.3.3 定量PCR

采用總RNA提取試劑盒對細胞總RNA進行提取，逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，定量PCR試劑盒進行定量。內參為GAPDH，引物序列GAPDH-F(5’→3’): GCACCGTCAAGGCTGAGAAC；GAPDH-R(5’→3’): TGGTGAA-GACGCCAGTGGA；Axl引物序列為Axl-F(5’→3’): CCGGGTTCATCAACATC AA；Axl-R(5’→3’): CTGACATTCTCGAGATCGA。

1.3.4 Western blot檢測

用RIPA裂解液將細胞裂解并用細胞刮收集，測定總蛋白濃度后，每孔上樣40 μg蛋白，150 V恒壓電泳40 min，100 V恒壓轉PVDF膜1 h。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜后，相應二抗室溫孵育2 h，通過ECL試劑盒發光檢測。

1.3.5 免疫組化

組織切片于60℃烤箱烘烤2 h。常規脫蠟(依次為)：二甲苯、二甲苯、無水乙醇、無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，其中二甲苯浸泡10 min，乙醇浸泡5 min。抗原修復：在清水中漂洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中煮沸3 min(中火)，待高壓鍋中煮沸后將組織片置于其中高壓修復2 min，冷卻至室溫。滅活內源性過氧化氫酶：在清水中沖洗一段時間，加入3% H2O2浸泡10 min。血清封閉：將載玻片置于PBS中5 min，清洗2次，山羊血清封室溫下封閉30 min。加一抗：加入Axl抗體(稀釋濃度1∶300)，以PBS作為作為陰性對照組，4℃孵育過夜。加二抗：PBS中洗3次，每次5 min，加二抗，然后置于37℃溫箱中30 min。顯色：PBS中洗3次，每次5 min，擦干組織周圍的PBS后加DAB顯色劑。鏡下觀察組織染色情況至合適深淺。將顯色后的片子用清水沖洗15 min后，浸泡于蘇木精中染色1 min。脫水：水中沖洗5 min后，依次將載玻片放入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇、二甲苯、二甲苯。每個試劑中放置2 min，最后浸泡在二甲苯中，通風柜中用中性樹脂封片晾干。

1.3.6 表達分級判斷標準

免疫組化表達分級通過兩方面打分評判：(1)陰性為0；陽性占0%～33%的記作1；34%～66%的記作2；67%～100%的記作3。(2)染色強度：分別將未顯色、淺黃、棕黃和棕色記為0、1、2、3四個等級。將兩個評分相乘并分為0、1、2和3四個表達強度等級。

1.3.7 細胞免疫熒光染色

多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次后山羊血清封閉1 h。一抗4℃孵育過夜后，用相應熒光二抗室溫孵育2 h，DAPI室溫染色10 min，加入抗淬滅劑封片保存。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 胃癌組織中Axl高表達

為了觀察胃癌組織中Axl的表達情況，我們收集了本院消化外科胃癌手術病人手術切除組織并制作胃癌組織芯片。經過免疫組化染色，Axl在胃癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織(圖1)。101例免疫組化統計結果見表1。胃癌組織中，強度為中陽性(++)和強陽性(+++)分別有34例和7例，而在癌旁組織中，強度為中陽性(++)和強陽性(+++)分別只有5例和0例。胃癌組織中Axl表達量顯著高于癌旁組織(P<0.001)。

2.2 Axl高表達細胞構建

為了深入研究Axl高表達與胃癌發生發展之間的關系，我們首先構建了高表達Axl的SGC-7901細胞。經過慢病毒Let-Axl的轉染，通過定量PCR技術檢測表明，SGC-7901/Let-Axl中Axl mRNA的含量顯著高于SGC-7901/Let-Null組(P<0.001，圖2 A)。進一步檢測發現，SGC-7901/Let-Axl中Axl蛋白含量顯著高于SGC-7901/Let-Null(圖2B)。免疫熒光染色也表明SGC-7901/Let-Axl細胞中Axl含量明顯升高(圖2C)。

注：A：胃癌組織；B：癌旁組織。

表1胃癌組織與癌旁組織Axl蛋白表達水平

Table1Axl expression levels in gastric cancer tissues and adjacent tissues

組別Groups表達分級Rank-++++++nP胃癌組織Gastric cancer tissues3030347100癌旁組織Adjacent tissues692750101<0.001

注：A：定量PCR結果；B：Western blot檢測Axl表達量；C：免疫組化結果。**P<0.01，***P<0.001。比例尺為20 μm。

注：A：小動物活體成像結果；B：小動物活體成像熒光強度統計(皮下注射腫瘤細胞4周后)。**P<0.01。

2.3 小動物活體成像檢測Axl對胃癌腫瘤的影響

為了進一步研究Axl高表達對胃癌的影響，我們進行了裸鼠皮下胃癌細胞成瘤實驗。在分別注射Axl高表達細胞SGC-7901/Let-Axl及其對照細胞SGC-7901/Let-Null兩周后，通過小動物活體成像可以看出，高表達Axl的SGC-7901細胞所成皮下瘤熒光強度大于對照組，在注射腫瘤細胞4周后，再次進行小動物活體成像，結果顯示，SGC-7901/Let-Axl所成皮下瘤熒光強度顯著大于對照組(圖3A)。熒光強度分析結果顯示，注射SGC-7901/Let-Axl所形成腫瘤在小動物活體成像下熒光強度顯著高于SGC-7901/Let-Null(P<0.01，圖3B)。以上結果顯示，SGC-7901/Let-Axl成瘤能力顯著高于SGC-7901/Let-Null，Axl高表達可以增強胃癌細胞SGC-7901的皮下成瘤能力。

2.4 高表達Axl增強胃癌細胞皮下成瘤能力

裸鼠皮下接種胃癌細胞4周后，SGC-7901/Let-Axl所形成的腫瘤明顯大于SGC-7901/Let-Null組(圖4A、4B)。處死裸鼠后，取出皮下瘤，對其體積和重量進行測量。相對于對照組SGC-7901/Let-Null，高表達Axl細胞SGC-7901/Let-Axl所形成的皮下瘤的體積顯著增大(P<0.01，圖4C)，質量也顯著增大(P<0.01，圖4D)。這些結果表明，Axl高表達能夠增強胃癌細胞皮下成瘤能力。

3 討論

胃癌是我國第二大惡性腫瘤，致死率亦位居第二[1]。盡管胃癌的診斷和治療技術有了很大改進，但胃癌患者的5年總生存率仍然不能令人滿意[2]。癌癥化療治療方案中，RTKs是一類極其重要的靶點。進一步深入研究RTKs與胃癌的關系，具有重要的臨床意義。

Axl是RTKs家族中重要的一員，在多種腫瘤中有過表達或異位表達，可以激活相關通路參與腫瘤的增殖、遷移、轉移、凋亡抑制和耐藥性[16]。研究表明，急性白血病細胞可以誘導骨髓間質細胞分泌Gas6，從而介導表達Axl的急性白血病細胞進行增殖、存活和耐藥性。在食管鱗狀細胞癌中，Axl高表達且與生存期呈負相關[17]。在胰腺癌中，Axl與淋巴結轉移呈現正相關，與生存期呈現負相關[18]。在肝癌中，Axl可以促進原發性肝癌的細胞增殖和侵襲能力[19]。

在本研究中，我們檢測了進行胃癌外科手術患者的胃癌及癌旁組織中的Axl的表達量，結果顯示，胃癌組織相比與癌旁組織，Axl表達量顯著升高，這提示Axl與胃癌的發生發展可能具有密切的關系。為了確定Axl參與胃癌發生發展，我們構建Axl高表達胃癌細胞，在裸鼠體內進行皮下成瘤，通過小動物活體成像檢測證實，Axl高表達能夠顯著提高胃癌細胞的皮下成瘤能力，處死動物后，取瘤組織測量體積和重量，確認了與活體成像結果的一致性。本研究一系列結果提示，Axl與胃癌的發生和發展可能具有密切的關系。

Axl已成為多種腫瘤的治療靶點和潛在的生物標志物，多種針對Axl的小分子抑制劑也已面市。我們通過本研究證實，Axl與胃癌的發生和發展可能具有密切的關系，可能可以作為胃癌預防、早診及治療的關鍵分子。基于本研究結果，經過后續深入研究探索，有望開發出以Axl為靶點治療胃癌的新型有效的抗腫瘤藥物和以Axl為胃癌標志物的診斷試劑盒。

注：A：裸鼠皮下瘤生長情況；B：Axl高表達及對照組所形成的皮下瘤；C：皮下瘤體積；D：皮下瘤質量。**P<0.01。紅色圓圈所示為裸鼠皮下瘤。