亞致死劑量γ-射線全身照射對小鼠造血免疫功能遠期影響

管博文，盧延華，蘇路路，李程程，荊學雙，董銀萍，王月英，李德冠*，孟愛民*

(1.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，國家衛生健康委員會人類疾病比較醫學重點實驗室，北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心，北京 100021；2.中國醫學科學院/北京協和醫學院放射醫學研究所，天津市放射醫學與分子核醫學重點實驗室，天津 300192)

隨著科學技術的進步，核電設施使用增多，人類太空活動能力提升使輻射暴露的可能性不斷增加。另外臨床接受放射性治療癌癥患者也在不斷上升。造血系統和免疫系統對電離輻射(ionizing radiation，IR)具有高度的敏感性。受照后不僅會引起急性骨髓抑制，對遠期造血免疫也會有影響。

受到亞致死劑量照射后會出現造血免疫系統急性損傷性變化。隨著時間延長機體各項免疫指標逐步恢復，但也會出現一些持久性改變，從而影響機體的健康狀態，本文對在4 Gy、6 Gy亞致死劑量γ射線全身照射(total body irradiation，TBI)后6個月C57BL/6 J小鼠的各項免疫指標進行檢測，為照射后造血免疫功能長期損傷研究提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

10～12周齡SPF級雄性C57BL/6 J小鼠，體重22～24 g，共24只，購于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]。小鼠飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所動物房屏障環境[SYXK(津)2014-0002]。本實驗經過中國醫學科學院放射醫學研究所IACUC的批準，批準號為1402，并根據3R原則對實驗動物的使用和飼養給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

熒光標記抗體NK1.1-FITC購于Biolegend公司；CD11b-APC購于Invitrogen公司；B220-percp、F4/80-PE、CD4-PE-cy7、CD8a-APC-cy7購于BD公司；B220-percp-cy5.5、CD3-APC購于Biolegend公司；EDTA-K3購于Sigma公司；紅細胞裂解液購于Invitrogen公司；大鼠脾單個核細胞分離液試劑盒購于索萊寶公司；EasySepTMMouse T Cell Isolation Kit購于STEMCELL Technologies公司。全自動血液分析儀MEK-7222 K(日本光電)；BD流式分析儀(BD FACSAria II cell sorter，BD Bioscience)；銫源伽馬射線輻照儀(Gammacell-40，加拿大原子能有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與照射

小鼠隨機分為對照(control)組、4 Gy IR組和6 Gy IR組。照射組接受137Csγ射線一次性全身照射4 Gy或6 Gy，劑量率為1Gy/min。對照組接受假照射。

1.3.2 外周血細胞計數及分類

將小鼠稱重，0.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(50 mg/kg)。進行內眥靜脈取血，EDTA-K3抗凝，血細胞計數儀測定外周血計數及分類[1]。

1.3.3 免疫臟器系數

小鼠稱重后，分別取胸腺和脾并稱重，記錄下用于計算胸腺系數和脾系數。臟器系數=臟器重量(mg)/小鼠體重(g)[2-3]。

1.3.4 外周血免疫細胞和脾淋巴細胞分型檢測

將分離的小鼠脾研磨制備脾細胞懸液。分別取外周血和脾細胞懸液50 μL，各加入1 mL 1×紅細胞裂解液，室溫條件下裂解8 min(期間混勻兩次)，1500 r/min離心5 min，4℃。棄去上清，每個樣品加入100 μL PBS重懸，分別加入對應的混合抗體，冰上避光孵育30 min。2 mL PBS洗一遍，離心條件保持不變。加入300 μL PBS重懸并過濾至流式管，上機檢測[4]。

1.3.5 脾T細胞分離及p16 mRNA表達量檢測

按索萊寶ficoll試劑盒和STEMCELL Technologies的T細胞陰選試劑盒說明書方法進行分離。將收集的細胞重懸計數，按每1× 106～5 × 106個細胞加入1 mL TRIzol保存，送至上海歐易生物醫學科技有限公司檢測p16 mRNA表達量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 外周血計數及分類

外周血計數結果如圖1，與對照組相比，受照后6個月小鼠白細胞計數、紅細胞計數和血紅蛋白濃度均有一定程度的下降。其中4 Gy組與對照組相比，白細胞計數從8.62 ± 1.52下降到7.01 ± 0.8，下降了18.65%(P<0.001)。紅細胞計數從8.99 ± 0.36下降到8.56 ± 0.33，下降了4.70%(P<0.05)。血紅蛋白和血小板組差異沒有顯著性。

6 Gy照射6個月后，與對照組相比，白細胞計數從8.62 ± 1.52下降到5.94 ± 0.83，下降了31.00%(P<0.001)。紅細胞計數也從8.99 ± 0.36下降到8.33±0.26，下降了7.27%(P<0.001)。血紅蛋白濃度，6 Gy組比對照組從123.13 ± 5.51下降到113.75 ± 2.71，下降了7.55%(P<0.001)。血小板計數6 Gy組和對照組相比未見顯著性差異。可以看出血小板計數基本以恢復到正常水平，見圖1A～1D。

4 Gy與6 Gy兩組間比較發現，只有血紅蛋白濃度這項指標在4 Gy和6 Gy之間有明顯降低，呈極顯著性差異(P<0.01)，相差5.04%。外周血計數各項指標均無計量依賴性，各項指標均恢復到正常范圍。

中性粒細胞百分比，4 Gy和6 Gy組相較于對照組有明顯上升，分別從(8.3 ± 1.09)%上升到(15.46 ± 1.94)%(P<0.001)和(16.87 ± 6.89)%(P<0.05)。淋巴細胞百分比從(90.95 ± 1.9)%下降到(85.29 ± 3.19)%(P<0.01)和(82.75 ± 7.06)%(P<0.05)，分別具有極顯著性和顯著性。見圖1E～1F。

外周血白細胞計數及分類結果顯示，亞致死劑量全身照射后6個月，外周血計數及分類已經恢復正常。但是白細胞、紅細胞計數仍然明顯低于對照組。白細胞降低有照射劑量依賴的趨勢。外周血細胞分類結果顯示照射組小鼠中性粒細胞比例升高、淋巴細胞比例下降，呈現細胞分化偏移現象，未見明顯的劑量效應關系。

注：A：白細胞計數；B：紅細胞計數；C：血紅蛋白濃度；D：血小板計數；E：中性粒細胞百分比；F：淋巴細胞百分比。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.2 免疫臟器系數

與對照組小鼠相比，4 Gy組和6 Gy組小鼠胸腺系數降低，其中6 Gy組與對照組差異有顯著性(P<0.05)；脾系數略有增加，差異無顯著性，結果見圖2。

注：A：胸腺系數；B：脾系數。*P<0.05。

2.3 外周血免疫分型

外周血采用流式分析法進行分型測定。檢測輔助T細胞(CD4)、細胞毒T細胞(CD8a)、B淋巴細胞(B220)、自然殺傷細胞(NK1.1)，單核細胞采用F4/80和CD11b共標。其中輔助T細胞、細胞毒T細胞和B淋巴細胞是從單個核細胞亞群去分析，NK細胞和單核細胞是從白細胞群去分析。如圖3所示。

結果顯示，相對于對照組，4 Gy組和6 Gy組CD4+均有上升，從(12.49±1.16)%分別上升到(14.6±0.51)%和(16.48±2)%，差異均具有顯著性(P<0.05)。CD8a+細胞三個組別之間未見明顯變化。CD4/CD8比值分別為對照組1.16±0.10，4 Gy照射組1.28±0.17，6 Gy照射組1.46±0.26，6 Gy組CD4/CD8比值與對照組比較有明顯上升(P<0.05)。B220+細胞從對照組(62.89±2.33)%降低到4 Gy照射組(55.63±3.61)%和6 Gy照射組(54.2±3.54)%，差異均具有極顯著性(P<0.001)。NK1.1+細胞與B220+細胞變化趨勢一樣，從(8.44±0.7)%分別降低到(6.81±1.58)%和(6.6±0.65)%。上述三組4 Gy和6 Gy之間差異均無顯著性區別。單核細胞三個組別之間未見到明顯差異。結果見圖4。

注：A：CD4+；B：CD8+；C：B220+；D：NK1.1+；E：CD11b+F4/80+；F：CD4+/CD8+。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

外周血細胞免疫分型結果顯示，4 Gy、6 Gy照射后，B淋巴細胞、NK細胞仍然低于對照組，提示受照后6個月未完全恢復。受照組CD4比例高于對照組。CD8單核細胞與對照組未見差異。

2.4 脾免疫細胞分型

采用流式細胞術分析脾中T細胞(CD3)和B淋巴細胞(B220)在脾單個核細胞分群中的占比變化。如圖5所示。

圖5 流式分析脾免疫細胞門的設置及示意圖

結果顯示，相較于對照組，照射組CD3+細胞有上升的趨勢，但無顯著性差異。B220細胞，照射組均有明顯下降，4 Gy組和6 Gy組相較于對照組有極顯著差異(P<0.01)，兩組之間未見明顯差異。見圖6。

注：A：CD3+；B：B220+。**P<0.01。

2.5 脾T細胞p16 mRNA表達量檢測

為了進一步研究照射對小鼠免疫細胞的遠期影響，分離小鼠脾T細胞，用RT-PCR檢測照射后6個月脾T細胞中p16 mRNA表達，檢測結果通過標準曲線公式以2-ΔΔCt進行比較。結果顯示，與對照組相比，6 Gy組有個別數據p16 mRNA明顯升高，采用卡方檢驗，未見顯著性差異。結果見圖7。

圖7 受照組小鼠與對照組小鼠脾T細胞的p16 mRNA表達比較

3 討論

本研究檢測亞致死劑量電離輻射全身照射對小鼠造血系統和免疫系統造成的遠期損傷。與對照組比較，結果顯示小鼠受到4 Gy或6 Gy全身照射6個月后，外周血白細胞計數、紅細胞計數和血紅蛋白濃度仍低于對照組。而照射組小鼠中性粒細胞比例升高，淋巴細胞的比例降低。提示受到照射后，與對照組比較外周血白細胞仍然處于較低水平，可能導致機體抵抗力下降。外周血分類比例改變，提示出現了分化偏移現象。但是除了血紅蛋白外，6 Gy組與4 Gy組差異沒有統計學意義。說明在經過長時間恢復后，外周血和免疫細胞比例已經基本恢復。

小鼠胸腺對電離輻射十分敏感，在接受照射6個月后，胸腺系數依舊未恢復至對正常水平。另一免疫器官，脾系數雖和對照組無顯著差別，外周血免疫分型中，照射組小鼠CD4+細胞占單個核細胞亞群的百分比上升，B淋巴細胞下降，自然殺傷細胞在白細胞群中的百分比明顯下降。提示照射引起天然免疫和適應性免疫功能下降。淋巴細胞比例下降，以B淋巴下降為主；天然免疫功能下降以NK細胞下降為主。脾免疫分型中，B淋巴細胞在脾單個核細胞百分比降低。在脾T細胞中，6 Gy照射6個月后p16 mRNA表達量高于對照組，但無顯著性差異。

課題組對輻射引起的造血系統免疫損傷進行了系統研究。小鼠外周血計數結果顯示，受照后大部分指標恢復正常，但是白細胞計數、紅細胞計數和血紅蛋白濃度依然低于對照組。路璐等研究結果顯示，6 Gy照射2個月內，白細胞和血小板下降程度明顯，紅細胞和血紅蛋白下降較為平緩[5]。兩個月內恢復的趨勢也與本研究結果一致。造成這種現象的原因可能是造血系統對輻射損傷敏感，亞致死劑量的電力輻射造成了造血干細胞(hematopoietic stem cell，HSC)損傷和衰老，影響其造血免疫功能，最后導致了度過了照射后初期白細胞血小板快速下降，以及中期紅細胞和血紅蛋白的下降后，遠期(照射后6個月)外周血計數雖在緩慢恢復，但依然低于對照組。隨著小鼠受照后時間的延長，造血干細胞的衰老和損傷會導致其分裂分化能力降低，進一步導致其數量減少，最終出現長期骨髓抑制等情況[6]。外周血細胞分類結果顯示照射組小鼠中性粒細胞比例升高、淋巴細胞比例下降，呈現細胞分化偏移現象，沒有明顯劑量反應關系。與老年小鼠外周血計數結果一致，暗示著照射導致的骨髓細胞出現了病理性的衰老改變[7]。在老年機體中，HSC不能保持細胞靜止狀態，并趨向于向髓系細胞進行分化，使得幼稚淋巴細胞數量下降。最終導致免疫功能整體下降。發生髓系分化偏移除了會造成免疫功能的下降，還會使髓系白血病發生的危險性升高。在急性髓系白血病中，主要是由白血病前體干細胞異常增殖導致的。而白血病前體干細胞傾向分化為髓系細胞[8]。亞致死劑量受照小鼠遠期仍然表現出髓系偏移的變化，與老年小鼠一致。

照射組小鼠的胸腺系數出現明顯下降，胸腺對電離輻射損傷敏感，在6個月后依舊沒有恢復到正常水平。受照組小鼠脾系數有少許上升，但與對照組相比，無顯著性差異。李德冠等[9-10]的研究顯示，照射組小鼠受4 Gy和6 Gy照射10周后胸腺系數脾系數分別出現上升或下降的改變，但均無顯著性差異，且不呈劑量依賴性。胸腺受損會導致T細胞在發育過程中出現問題，減少幼稚T細胞的數量，進而影響細胞免疫效果。

外周血分型與李德冠等人[11]的研究比較發現在6 Gy照射后10 d時，小鼠處于輻射損傷急性期，外周血CD4、CD8、B220分別從(19.7 ± 4.7)%、(18.5 ± 1.7)%和(52.0 ± 6.6)%降到(15.5 ± 2.0)%、(5.1 ± 2.9)%和(7.9 ± 4.1)%。在10周時，4 Gy組和6 Gy組CD4從(12.1 ± 0.9)%分別上升到(18.7 ± 0.4)%和(21.9 ± 7.4)%，CD8由(11.7 ± 0.8)%分別上升至(17.2 ± 2.1)%和下降到(8.8 ± 0.6)%，B220則從(50.6 ± 6.5)%分別下降到(38.1 ± 2.9)%和(23.7 ± 12.2)%[9-10]。變化趨勢與本研究照射后6個月時的外周血免疫分型結果接近。本實驗中，CD4%的上升是源于在單個核細胞群中，CD4陽性細胞隨時間的恢復，且B220陽性細胞死亡比例較高恢復較慢導致的，屬于相對升高。崔玉芳等人[12]在研究中認為小鼠受照后免疫方面有兩個特點：①短期內損傷嚴重，②后期階段機體恢復速度緩慢。其中特別的是，在受到照射后6～12月，淋巴細胞仍處于恢復階段時，外周血淋巴細胞的凋亡率仍高出正常水平。CD3和CD8陽性T細胞仍未恢復到對照的水平[12]。本實驗中，先天免疫主要以NK細胞的減少為主，單核細胞照射組與對照組之間基本無差別，淋巴細胞中B細胞依舊處于緩慢恢復階段，T細胞則恢復明顯。與吳安慶等人[13]的研究中提出的淋巴細胞比單核細胞輻射敏感性強，淋巴細胞中B細胞也比T細胞對輻射更加敏感的結論相一致。6 Gy組CD4%/CD8%與對照組相比差異有顯著性(P<0.05)，但比值的上升主要是因為CD4%的相對上升，與免疫系統亢進不一樣。

之后進行脾免疫細胞分型中發現，B淋巴細胞在單個核細胞中的比例有明顯下降，并具有極顯著差異(P<0.01)。說明雖然在脾系數上與對照組沒有區別，但是功能上還沒有恢復至對照組水平。B淋巴細胞比例的下降可能會導致獲得性免疫中體液免疫水平的降低。進一步造成抗體數量的減少和免疫記憶的減弱，無法及時在抗原入侵機體時有效的啟動免疫應答。

p16基因是一種直接參與細胞周期調控的細胞周期基因，同是也是一個抑癌基因。在受到一些細胞因子或是DNA損傷刺激下，會激活p38MAPK級聯反應，進而激活p16-Rb通路，造成細胞的衰老，是常用的衰老標志物[14]。我們前期研究結果顯示，亞致死劑量全身照射可以引起造血干細胞衰老，表現為p16升高，自我更新能力下降[15-16]。臨床研究顯示細胞毒性化療藥物及骨髓移植患者T細胞中p16表達水平明顯升高[17]。本研究中，6 Gy組結果顯示在8個有效數據中，有2例明顯升高，但無顯著性差異。T細胞p16 mRNA是否可以作為受照后引起的衰老生物學標志有待進一步研究認證。

本項研究對中高劑量照射對小鼠造血免疫遠期損傷初步分析結果顯示，受照組小鼠在經過6個月的恢復后，免疫系統基本重建完畢，趨于穩定。但髓系淋系分化偏移，B淋巴細胞比例下降等仍持續存在。這與造血免疫系統老齡化改變相似。討論中比較了照射后不同時間點造血免疫損傷程度及恢復情況，也與老年小鼠進行了比較。這些初步探討進一步驗證了亞致死劑量照射引起了小鼠造血免疫系統衰老性改變，為治療改善遠期輻射損傷提供了基礎數據，也為受照小鼠用于造血免疫系統老年性改變機制研究提供支持。