用凍干菌液進(jìn)行豬丹毒、多殺性巴氏桿菌病 二聯(lián)滅活疫苗效力檢驗(yàn)的研究

邵慶紅，邢佳鵬，朱文革，張連祥，方鵬飛

(北京華信農(nóng)威生物科技有限公司，北京 102209)

豬丹毒病是由豬丹毒桿菌引起豬的一種烈性傳染病，發(fā)現(xiàn)較早，分布十分廣泛，世界各大洲凡養(yǎng)豬地區(qū)幾乎都有發(fā)生豬丹毒病的報(bào)道，給養(yǎng)豬業(yè)造成很大損失。我國是養(yǎng)豬大國，過去認(rèn)為豬丹毒主要發(fā)生在南方各地，但近些年東北、華北、西北等北方地區(qū)發(fā)病也較多。這主要是因?yàn)榻┠陮?duì)病毒病的重視，忽視了細(xì)菌病的防控，往往復(fù)雜的豬病情況和不良環(huán)境導(dǎo)致豬免疫力下降，給豬丹毒桿菌有機(jī)可乘。豬多殺性巴氏桿菌病與豬丹毒病類似，均屬條件致病菌，在正常條件下不會(huì)導(dǎo)致豬發(fā)病，但在環(huán)境比較差，如悶熱、寒冷、潮濕、營養(yǎng)缺乏、密度過大等不良條件下，導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，就會(huì)使病原繁殖，從而引起發(fā)病[1]。

疫苗接種是預(yù)防兩種病發(fā)生的有效的方法。目前，市場(chǎng)上有減毒活疫苗、滅活疫苗，皆有良好的免疫效果。豬丹毒、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗因使用安全、易于保存、對(duì)母源抗體的影響不敏感、不受抗生素的影響且可聯(lián)合免疫，得到廣泛的認(rèn)可[2]。

效力檢驗(yàn)是評(píng)價(jià)豬丹毒、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗保護(hù)效果的關(guān)鍵參數(shù)。此產(chǎn)品的效力檢驗(yàn)需要進(jìn)行動(dòng)物攻毒試驗(yàn)，在以往的檢驗(yàn)中，質(zhì)檢室一直使用新鮮菌液進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。這就需要在檢驗(yàn)工作中進(jìn)行大量的前期準(zhǔn)備工作，如培養(yǎng)基配制、菌液繁殖、活菌計(jì)數(shù)、最小致死量確定等等，檢驗(yàn)程序繁瑣，工作量大。新鮮菌液一般在效力檢驗(yàn)攻毒前7 d制備完畢，在進(jìn)行攻毒試驗(yàn)之前攻毒用菌液置于2～8 ℃冷藏狀態(tài)中保存，但活菌數(shù)隨著時(shí)間的延長而逐漸下降，從而會(huì)影響最終檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，而將菌液凍干更易于長期保存，也能減少檢驗(yàn)人員的工作量[3]。本研究就凍干保存的攻毒菌與新鮮菌液進(jìn)行攻毒對(duì)比試驗(yàn)，并對(duì)凍干菌進(jìn)行保存期驗(yàn)證，以期能將新鮮的攻毒菌液凍干保存用于產(chǎn)品的攻毒保護(hù)試驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 豬丹毒、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗，由北京華信農(nóng)威生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為183602、183603，規(guī)格為20 mL/瓶，物理性狀檢驗(yàn)和安全檢驗(yàn)及其他檢驗(yàn)項(xiàng)目均合格。

1.1.2 攻毒用菌種 豬丹毒桿菌1型C43-8株(CVCC 43008)和2型C43-6株(CVCC 43006)、多殺性巴氏桿菌C44-8株(CVCC 44408)強(qiáng)毒菌液，基礎(chǔ)菌種購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，由北京華信農(nóng)威生物科技有限公司質(zhì)檢室自繁并鑒定合格，20%甘油，-70 ℃保存。其中，C43-6株、C43-8株同比例混合進(jìn)行豬丹毒部分的效力檢驗(yàn)，C44-8株進(jìn)行豬多殺性巴氏桿菌病部分的效力檢驗(yàn)。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬丁肉湯，購自中海生物科技有限公司；裂解血細(xì)胞全血，購自北京平睿生物科技有限公司。

1.1.4 凍干保護(hù)劑 5%蔗糖脫脂牛奶凍干保護(hù)劑，由北京華信農(nóng)威生物科技有限公司質(zhì)檢室自制，經(jīng)116 ℃、15 min高壓滅菌處理。

1.1.5 試驗(yàn)動(dòng)物 16～18 g清潔級(jí)小鼠，昆明系，雄性，76只，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司；體重1.5～2.0 kg普通級(jí)兔，日本大耳白，性別不限，20只，購自北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司。

1.1.6 小型冷凍干燥機(jī) LABCONCO。

1.2 方法及判定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 豬丹毒部分的效力檢驗(yàn) 每批疫苗用體重16～18 g小鼠32只，分為凍干菌組和新鮮菌液組，每組設(shè)有免疫1組和免疫2組，同時(shí)設(shè)空白不免疫對(duì)照1組和對(duì)照2組。小鼠皮下接種疫苗21 d后，各免疫組和對(duì)照組分別用相應(yīng)的豬丹毒桿菌混合菌液進(jìn)行攻毒。攻毒后觀察10 d，每組注射1000 MLD(Minimum Lethal Dose，最小致死量，簡(jiǎn)寫MLD)的對(duì)照小鼠應(yīng)全部死亡，注射1 MLD的對(duì)照小鼠至少死亡2只，免疫小鼠應(yīng)至少保護(hù)7只[4]。具體免疫方案和攻毒劑量見表1。

表1 豬丹毒部分效力檢驗(yàn)Tab 1 The detection of swine erysipelas

肩標(biāo)*表示此組小鼠皮下注射4倍稀釋的疫苗，即1份疫苗加3份40%氫氧化鋁膠生理鹽水的混合液

1.2.2 豬多殺性巴氏桿菌病部分的效力檢驗(yàn) 每批疫苗用體重1.5～2.0 kg兔12只，分為凍干菌組和新鮮菌液組，每組設(shè)有免疫組和空白不免疫對(duì)照組。在疫苗接種21 d后，各免疫組和對(duì)照組分別用相應(yīng)的C44-8株菌液進(jìn)行攻毒，皮下注射80～100 CFU(Colony-Forming Units，菌落形成單位，簡(jiǎn)寫CFU)。攻毒后觀察8 d，對(duì)照組兔應(yīng)全部死亡，免疫組兔應(yīng)至少保護(hù)2只[4]。具體免疫方案和攻毒劑量見表2。

表2 豬多殺性巴氏桿菌病部分效力檢驗(yàn)Tab 2 The detection of Pasteurella multocida

1.2.3 新鮮菌液的繁殖 馬丁肉湯培養(yǎng)基按配方進(jìn)行配制，分裝量為200 mL/瓶，按要求進(jìn)行滅菌。在滅菌合格的馬丁肉湯中加入0.5%的裂解血細(xì)胞全血混勻，分別按照1.5%的比例加入C43-6株、C43-8株、C44-8株三種甘油凍存菌，在37 ℃搖床培養(yǎng)5～6 h，手搖菌液呈明顯的云霧狀停止培養(yǎng)。

1.2.4 新鮮菌液的保存及凍干 將停止培養(yǎng)的三種菌液各取出100 mL，分別加入適宜比例的蔗糖牛奶保護(hù)劑混勻分裝至7 mL管制瓶，2.2 mL/瓶，放入凍干機(jī)進(jìn)行21～22 h的冷凍真空干燥，置于-70 ℃保存。將剩余的菌液置2～8 ℃冰箱冷藏保存。

1.2.5 活菌計(jì)數(shù)

1.2.5.1 新鮮菌液的活菌計(jì)數(shù) 將停止培養(yǎng)的菌液用馬丁肉湯進(jìn)行倍比稀釋，選擇合適稀釋度，平鋪法活菌計(jì)數(shù)，并多次復(fù)核最終確定攻毒前活菌數(shù)。

1.2.5.2 凍干菌的活菌計(jì)數(shù) 將經(jīng)冷凍真空干燥的凍干菌用1 mL馬丁肉湯進(jìn)行復(fù)原，并進(jìn)行倍比稀釋，選擇合適稀釋度，平鋪法活菌計(jì)數(shù)，并多次復(fù)核最終確定攻毒前活菌數(shù)。

1.2.6 豬丹毒桿菌最小致死量的測(cè)定 根據(jù)新鮮菌和凍干菌的活菌數(shù)，分別將C43-6和C43-8按活菌數(shù)進(jìn)行同比例混合，選擇不同的菌數(shù)劑量進(jìn)行小鼠攻毒試驗(yàn)，能使小鼠死亡的最小活菌數(shù)為豬丹毒桿菌對(duì)小鼠的最小致死量。

1.2.7 凍干菌種保存期驗(yàn)證試驗(yàn) 將凍干的豬丹毒桿菌和豬多殺性巴氏桿菌自凍干日期起保存2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月、8個(gè)月、10個(gè)月、12個(gè)月分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，監(jiān)測(cè)凍干菌在保存過程中的衰減情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬丹毒桿菌最小致死量 將2～8 ℃保存豬丹毒桿菌的新鮮混合菌液和-70 ℃保存的凍干混合菌種分別選擇4個(gè)劑量注射小鼠，小鼠死亡情況見表3。可見，新鮮菌液的小鼠MLD為3.2 CFU，凍干菌種的小鼠MLD為6.7 CFU。

表3 豬丹毒桿菌混合菌液的小鼠最小致死量Tab 3 Minimum lethal dose in mice with erysipelas mixture

2.2 活菌計(jì)數(shù) 由于新鮮菌液在停止培養(yǎng)7～10 d內(nèi)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和MLD的計(jì)算且細(xì)菌的活菌計(jì)數(shù)只是一個(gè)相對(duì)值，故從表4的數(shù)據(jù)可以看出豬丹毒桿菌和豬多殺性巴氏桿菌新鮮菌液在攻毒前和攻毒時(shí)的活菌數(shù)雖有差異但并不顯著。另外，凍干菌種活菌計(jì)數(shù)需要用適宜培養(yǎng)基復(fù)融不易再次保存，攻毒前和攻毒后也只是復(fù)核活菌數(shù)，故沒有進(jìn)行攻毒后的活菌數(shù)對(duì)比。表5數(shù)據(jù)表明凍干后的菌種在-70 ℃保存一年細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果穩(wěn)定。

表4 活菌計(jì)數(shù)Tab 4 Live bacterial count

表5 凍干菌種保存期驗(yàn)證試驗(yàn)Tab 5 Test of lyophilized bacteria preservation period

2.3 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 豬丹毒部分效力檢驗(yàn)攻毒保護(hù)結(jié)果 兩批疫苗的豬丹毒部分效力檢驗(yàn)分別用新鮮菌液和凍干菌種進(jìn)行小鼠攻毒試驗(yàn)，詳細(xì)數(shù)據(jù)見表6。新鮮菌液組注射1 MLD劑量的對(duì)照組2小鼠全部死亡，注射1 000 MLD劑量的對(duì)照組1的小鼠全部死亡，183602批免疫組小鼠有9/10只保護(hù)，183603批免疫組的小鼠有8/10只保護(hù)。凍干菌液組注射1 MLD劑量的對(duì)照組2的小鼠全部死亡，1000 MLD劑量的對(duì)照組1的小鼠全部死亡，183602批免疫組的小鼠有10/10只保護(hù)，183603批免疫組小鼠有10/10只保護(hù)。

表6 兩批豬丹毒部分效力檢驗(yàn)Tab 6 The detection of swine erysipelas

肩標(biāo)*表示以攻毒時(shí)活菌計(jì)數(shù)的量計(jì)算，單位是CFU

2.3.2 豬多殺性巴氏桿菌病部分效力檢驗(yàn)攻毒保護(hù)結(jié)果 兩批疫苗的豬多殺性巴氏桿菌病部分效力檢驗(yàn)分別用新鮮菌液和凍干菌液進(jìn)行兔子攻毒試驗(yàn)，詳細(xì)數(shù)據(jù)見表7。新鮮菌液組對(duì)照組兔2/2死亡，183602批免疫組兔子3/4保護(hù)，183603批免疫組兔子2/4保護(hù)。凍干菌液組對(duì)照組兔2/2死亡，183602批免疫組兔3/4保護(hù)，183603批免疫組兔子3/4保護(hù)。

從表7數(shù)據(jù)看出新鮮菌液和凍干菌種的攻毒劑量基本一致，這是由于此產(chǎn)品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為攻含活菌80～100 CFU，而C44-8對(duì)兔的最小致死量至多為10 CFU[5]，故豬多殺性巴氏桿菌病部分效力檢驗(yàn)部分無論新鮮菌液還是凍干菌種攻毒用活菌數(shù)都控制在90 CFU左右。

表7 兩批豬多殺性巴氏桿菌病部分效力檢驗(yàn)Tab 7 The detection of Pasteurella multocida

肩標(biāo)*表示以攻毒時(shí)活菌計(jì)數(shù)的量計(jì)算，單位是CFU

3 討論與結(jié)論

新鮮菌液在冷藏狀態(tài)中細(xì)菌活性逐漸衰減，最佳保存時(shí)間僅為一周左右，而凍干菌種在12個(gè)月的監(jiān)測(cè)期內(nèi)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果穩(wěn)定，更易于長期保存[6-8]，故利用凍干菌進(jìn)行攻毒試驗(yàn)在保證攻毒菌數(shù)準(zhǔn)確的前提下，避免了每個(gè)批次的產(chǎn)品檢驗(yàn)都進(jìn)行菌種繁殖、重復(fù)計(jì)數(shù)復(fù)核等工作，也降低了攻毒失敗的風(fēng)險(xiǎn)，簡(jiǎn)化檢驗(yàn)操作，提高工作效率，是值得推行的方法。

凍干菌種相對(duì)新鮮菌液有一定優(yōu)勢(shì)，但凍干過程可能會(huì)影響細(xì)菌體內(nèi)部分酶的活性，降低細(xì)菌的活力和致病性[9-10]，導(dǎo)致最小致死劑量會(huì)發(fā)生變化，因此應(yīng)定期對(duì)凍干菌種的毒力進(jìn)行監(jiān)測(cè)，外加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異，每次攻毒前應(yīng)當(dāng)測(cè)定凍干菌種對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的最小致死劑量。

此研究利用兩批產(chǎn)品的效力檢驗(yàn)進(jìn)行了凍干菌種和新鮮菌液的攻毒試驗(yàn)對(duì)比，凍干菌種在試驗(yàn)中能夠達(dá)到新鮮菌液同等的檢驗(yàn)結(jié)果。另外在長期保存過程中凍干保存的菌種活菌數(shù)穩(wěn)定，可以保證對(duì)照組死亡，檢驗(yàn)成立。初步說明將攻毒用菌液進(jìn)行凍干保存用于豬丹毒、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗效檢攻毒試驗(yàn)是可行的。