響應(yīng)面法優(yōu)化瓊辣蓼總黃酮提取 工藝及其抗氧化活性研究

趙雅媚，盛琳，王寧，任守忠

(海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點實驗室，海口 571199)

辣蓼(PolygonumhydropiperLinn.) 為蓼科(Polygonaceae)蓼屬(Polygonum)植物辣蓼的干燥全草,具有除濕、殺蟲、祛風(fēng)、化滯之功效[1]。研究表明，蓼屬植物的化學(xué)成分中均含有大量具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物黃酮類化合物，能夠祛風(fēng)利濕、止痛散瘀、消腫解毒，主要用于治療風(fēng)濕寒性關(guān)節(jié)痛、腸胃炎、瘡疥、寒痢、腹瀉等疾病[2-3]。揮發(fā)油、黃酮類及萜類是辣蓼的主要成分，其中總黃酮的含量最高。張國英[4]利用系統(tǒng)預(yù)實驗方法對辣蓼的化學(xué)成分進(jìn)行了檢測，主要有蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、山柰酚、異鼠李素等5個黃酮類化合物，其有強抗氧化活性，清除人體內(nèi)部自由基等作用[5]。隨著對黃酮研究的深入，從植物中提取分離總黃酮的方法己有大量文獻(xiàn)報道，但有關(guān)瓊辣蓼中黃酮類化合物的提取及工藝優(yōu)化方面的文獻(xiàn)較少。

響應(yīng)曲面設(shè)計方法是一種綜合試驗設(shè)計和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法[6]，具有試驗次數(shù)少、精度高、預(yù)測值精準(zhǔn)的優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥領(lǐng)域[7-8]。但采用響應(yīng)面法優(yōu)化瓊辣蓼中總黃酮的回流提取工藝目前未見文獻(xiàn)報道。鑒于此，本實驗通過比較水提法和醇提法，根據(jù)其試驗結(jié)果采用較優(yōu)的提取方法提取瓊辣蓼中的總黃酮，以提取液中總黃酮的百分含量為指標(biāo)，通過單因素實驗考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時間對總黃酮含量的影響，以響應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期得到一種簡單、安全、高效的辣蓼中總黃酮的最佳提取工藝，并探討總黃酮體外抗氧化活性，為進(jìn)一步拓寬瓊辣蓼總黃酮的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 辣蓼經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院曾年開教授鑒定為瓊辣蓼，采自海南省昌江縣；蘆丁對照品購于海南詣高儀器有限公司；二苯基苦味酰基苯肼(DPPH)，東京化成株式會社，>97.0%；谷胱甘肽(GSH)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，≥98%；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，上海麥克林生化科技有限公司，AR；水楊酸，硫酸亞鐵，濃過氧化氫等均為西隴科學(xué)股份有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純，水為蒸餾水。

1.2 儀器 UV-1800PC 紫外分光光度儀(上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司)；HC-150T2 型粉碎機(永康市綠可食品機械有限公司)；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴箱(金壇市白塔新寶儀器廠)；ML-204 萬分之一天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)； RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器有限公司)；DS-5510DTH超聲波清洗器(上海生析超聲儀器有限公司)

1.3 實驗方法

1.3.1 提取方法比較 準(zhǔn)確稱取粉碎后的藥材粗粉5 g，共6份。其中三份蒸餾水回流提取，加入25倍量蒸餾水，水浴加熱回流提取30 min，放冷，過濾，濾渣分別再次加入10倍量蒸餾水繼續(xù)回流，重復(fù)兩次后抽濾，合并三次濾液，濾液收集于100 mL容量瓶中，最后定容至刻度；另三份乙醇回流提取，加入25倍量70%乙醇，水浴加熱回流提取30 min，放冷，過濾，濾渣分別再次加入10倍量70%乙醇繼續(xù)回流，重復(fù)兩次后抽濾，合并三次濾液，濾液收集于100 mL容量瓶中，最后定容至刻度。

1.3.2 總黃酮提取液制備 將辣蓼55 ℃干燥至恒重，粉碎，過 40目篩，準(zhǔn)確稱取粗粉適量，加入適量乙醇，熱回流提取，過濾，濾渣加乙醇繼續(xù)回流提取，重復(fù)兩次，抽濾，合并三次濾液收集于100 mL容量瓶中，定容。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取蘆丁對照品10.0 mg，用60%乙醇超聲溶解，定容至50 mL，備用。分別吸取1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5.0 mL上述溶液，置于10 mL 量瓶中，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法顯色[9]，于510 nm 處測定吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 總黃酮含量測定 精密量取1.3.1、1.3.2項下提取液適量，置10 mL量瓶中，按1.3.3項下方法依次加入5%亞硝酸鈉(NaNO2)、10%硝酸鋁、4%氫氧化鈉顯色，定容，于510 nm 處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮的含量。

1.3.5 單因素試驗

1.3.5.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 準(zhǔn)確稱量藥材辣蓼粗粉3份于圓底燒瓶中，分別加入50倍量40%、50%、60%、70%乙醇，浸泡30 min，于80 ℃加熱回流提取30 min，放冷，過濾，藥渣分別再次加入20倍量40%、50%、60%、70%乙醇繼續(xù)回流提取，重復(fù)兩次后抽濾，合并三次濾液，濾液收集于100 mL容量瓶中，分別用40%、50%、60%、70%乙醇分多次洗滌，最后定容至刻度，搖勻。精密移取提取液溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按1.3.3項方法測定吸光度，根據(jù)回歸方程，計算各提取液中總黃酮含量。

1.3.5.2 液料比的選擇 準(zhǔn)確稱量藥材辣蓼粗粉3份于圓底燒瓶中，分別加入8、10、15、20倍量70%乙醇，浸泡30 min，于80 ℃水浴中加熱回流，分別提取30 min，放冷，過濾，濾渣分別再次加入8倍量70%乙醇繼續(xù)回流，重復(fù)兩次后抽濾，合并三次濾液，濾液收集于100 mL容量瓶中，用70%乙醇分多次洗滌，最后定容至刻度，搖勻。精密移取提取液溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按1.3.3項方法測定吸光度，根據(jù)回歸方程，計算各提取液中總黃酮含量。

1.3.5.3 提取時間的選擇 準(zhǔn)確稱量藥材辣蓼粗粉3份于圓底燒瓶中，分別加入50倍量70%乙醇(V/V)，于80 ℃水浴中加熱回流，分別提取120、90、60、30 min放冷，過濾，濾渣分別再次加入20倍量70%乙醇繼續(xù)回流，重復(fù)兩次后抽濾，合并三次濾液，濾液收集于100 mL容量瓶中，用70%乙醇分多次洗滌，最后定容至刻度，搖勻。精密移取提取液溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按1.3.3項方法測定吸光度，根據(jù)回歸方程，計算各提取液中總黃酮含量。

1.3.6 提取工藝優(yōu)化 在單因素實驗篩選的基礎(chǔ)上，對乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)、提取時間(C)3個因素，每個因素選擇的 3 個水平，分別以-1、0、1 進(jìn)行編碼。應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件，選用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計模型，設(shè)計三因素三水平中心組合試驗條件，并對實驗結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定最佳工藝條件(表1)。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Tab 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.3.7 抗氧化活性

1.3.7.1 DPPH自由基的清除測定 分別向試管中加入不同濃度樣品溶液2 mL，再分別加入2 mL 0.06 mg/mL DPPH溶液，渦旋混勻，避光放置30 min，以無水乙醇代替DPPH，同法操作，作為空白調(diào)零，在517 nm處測吸光度值A(chǔ)1。以無水乙醇代替DPPH，同法操作，用無水乙醇調(diào)零，測其在517 nm處的吸光度值A(chǔ)0。2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)為陽性對照，平行測定3次。按下式計算DPPH自由基的清除率。

清除率=(A0-A1)/A0×100%。A1：樣品組吸光度值；A0：對照組吸光度值。

1.3.7.2 羥基自由基的清除測定 分別向試管中加入不同濃度樣品溶液1 mL，再依次加入0.3 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液，0.3 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，用去離子水補齊至6 mL，搖勻后加入0.3 mL 8.8 mmol/L的H2O2溶液啟動反應(yīng)，在37 ℃保溫10 min，以去離子水代替H2O2溶液，同法操作，作為空白調(diào)零，在527 nm處測吸光值A(chǔ)1。以去離子水代替樣品溶液，同法操作，用去離子水調(diào)零，測527 nm處的吸光值A(chǔ)0。谷胱甘肽(GSH)為陽性對照，平行測定3次。按下式計算清除率。清除率=(A0-A1)/A0×100%。A1：樣品組吸光度值；A0：對照組吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理 用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，繪圖采用Origin 8.5軟件，響應(yīng)面分析用Design-Expert 8.0.6軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法結(jié)果比較 由圖1可知，醇提法提取液中的總黃酮百分含量，可達(dá)到5.014%，明顯高于水提法的1.923%，醇提法的提取效果更好。因此，以下研究采用醇提法。

圖1 提取方法對總黃酮含量的影響Fig 1 Effects of extracting method on total flavonoids content

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響 由圖2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)由40%升高至50%時，提取液中總黃酮的提取率逐漸增加，當(dāng)繼續(xù)升高到60%時，提取效果反而下降。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%作為響應(yīng)面法優(yōu)化試驗的中心點。

2.2.2 液料比對黃酮提取率的影響 由圖3可知，隨著液料比倍數(shù)的增加，辣蓼中總黃酮的提取率逐漸提高，當(dāng)液料比為1∶15時，總黃酮的提取率達(dá)到最大值，之后隨液料比增大而下降。因此，考慮到提取率和節(jié)約溶劑減少損耗兩方面的因素，選擇液料比1∶15作為響應(yīng)面試驗優(yōu)化試驗的中心點。

2.2.3 提取時間對黃酮提取率的影響 由圖4可知，在 30～60 min內(nèi)，隨著提取時間的延長，辣蓼總黃酮提取率逐漸升高；提取時間超過60 min后，繼續(xù)延長提取時間，提取率變化不顯著，且黃酮類化合物長時間處于高溫環(huán)境下，易被氧化破壞。因此，提取時間以60 min作為響應(yīng)面試驗優(yōu)化試驗的中心點。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對瓊辣蓼總黃酮提取率影響Fig 2 Effects of Ethanol concentration on extraction rate of flavonoids

圖3 料液比對瓊辣蓼總黃酮提取率的影響Fig 3 Effects of Solid-liquid ratio on extraction rate of flavonoids

圖4 提取時間對瓊辣蓼總黃酮提取率的影響Fig 4 Effects of Ethanol?time on extraction rate of flavonoids

2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析 以瓊辣蓼中總黃酮得率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，得到如下回歸方程：Y=9.25-0.12×A+0.32×B+0.52×C-0.47×AB+0.36×AC+0.10 ×BC-0.52×A2-0.23×B2+0.14×C2，對方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2～表3。

表2 Box-Behnken試驗結(jié)果Tab 2 Box-Behnken experiment result

表3 方差分析Tab 3 Analysis of variance

由表3可知，模型的P=0.024<0.05，差異顯著，表明該模型擬合度良好，得到的回歸方程能較好地反映各指標(biāo)與各因素之間的關(guān)系。模型的失擬項的P≥0.05，說明失擬項不顯著，可利用此模型來分析和預(yù)測乙醇回流提取辣蓼中的總黃酮含量[10]。從方差分析結(jié)果可以看出，方程中的B，AB對瓊辣蓼總黃酮提取的影響是顯著的(P<0.05)，說明B因素與A因素對總黃酮提取含量的影響是有交互作用而不是簡單線性關(guān)系；方程中C對瓊辣蓼總黃酮的提取影響是極顯著的(P≤0.01)。A，AC，BC，B2,C2對瓊辣蓼總黃酮提取的影響不顯著。因此，可以得出各因素對總黃酮提取率影響的大小順序為：提取時間(C)>料液比(B)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)。

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，由響應(yīng)面及回歸方程可得出瓊辣蓼黃酮類成分的最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為47.79%，液料比為15倍，提取時間為60 min，提取總黃酮百分含量預(yù)測值為10.120%。考慮到實際實驗過程中的可操作性，將優(yōu)化條件修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)48%，液料比15倍，提取時間60 min。

2.3.2 最優(yōu)工藝的驗證 按照修正后的工藝條件，進(jìn)行驗證試驗(n=3)，所得提取總黃酮的百分含量為10.101%，與預(yù)測值接近，結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定可行。

2.4 抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 瓊辣蓼總黃酮對DPPH自由基的清除作用如圖5所示，從圖5可知，在實驗設(shè)置的濃度范圍內(nèi)瓊辣蓼總黃酮對DPPH自由基的清除能力隨濃度增加而增大，IC50為0.46 mg/mL，但清除率低于BHT，其對DPPH自由基的清除能力為BHT的7.8%。

2.4.2 羥基自由基清除能力 瓊辣蓼總黃酮對羥基自由基清除作用如圖6所示，從圖6可以看出，在1～5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨濃度增加，清除能力增強，IC50為2.95 mg/mL，其對羥基自由基的清除能力優(yōu)于GSH。

圖5 總黃酮對DPPH自由基的清除率Fig 5 Scavenging capacity to DPPH free radical of flavonoids

圖6 總黃酮對羥基自由基的清除率Fig 6 Scavenging capacity to hydroxyl radical of flavonoids

3 討論與結(jié)論

辣蓼中主要活性成分為黃酮類成分，其中，蘆丁、槲皮苷、異鼠李素等為辣蓼中含量最多的黃酮類物質(zhì)。辣蓼總黃酮提取方法有浸漬法、索氏提取法、滲漉法、加熱回流法、超聲法等，不同提取方法各有優(yōu)缺點，目前，超聲法和熱回流法是最常用的兩種提取方法。羅文涓[11]等采用水煎醇沉法、浸提法、超聲法、超聲酶解法進(jìn)行辣蓼總黃酮的提取，結(jié)果表明，超聲法能耗低、黃酮得率高，優(yōu)于其他方法。而向蓉[12]等采用熱水、超聲、加熱回流、索氏法分別對辣蓼總黃酮進(jìn)行提取，其中超聲法和熱回流法總黃酮得率相差不大，都明顯高于熱水和索氏法。超聲提取雖能耗低，但不適用于大量藥材提取，而熱回流提取法不借助儀器，操作簡單，既可用于少量藥材提取，也可用于大量藥材提取，是較為理想辣蓼總黃酮的提取方法，所以本次研究選用乙醇熱回流提取。

從辣蓼中提取黃酮類成分是后續(xù)進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)，而優(yōu)化提取工藝是提高辣蓼中黃酮類成分提取率的關(guān)鍵。本實驗采用乙醇熱回流法對瓊辣蓼總黃酮進(jìn)行提取，在單因素的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法建立了瓊辣蓼中總黃酮提取工藝條件的二次多項數(shù)學(xué)模型，探討了乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時間對總黃酮提取含量的影響。結(jié)果表明：影響提取率的因素大小為提取時間>料液比>乙醇濃度，與文獻(xiàn)一致[13-14]，經(jīng)分析獲得了最佳提取條件為：料液比1∶15，乙醇濃度48%，提取時間60 min時，總黃酮提取率為10.101%。在此條件下，總黃酮的提取率高于部分文獻(xiàn)報道超聲提取法[15]，這可能與藥材產(chǎn)地、采收月份及選用部位等不同也有一定關(guān)系，何立美等報道辣蓼的產(chǎn)地、采收不同，其黃酮含量及類型差異很大[16]。辣蓼總黃酮具有一定抗氧化作用，體外抗氧化活性評價試驗結(jié)果表明瓊辣蓼總黃酮對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和羥基自由基都有清除作用，且呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，樣品濃度越高，清除自由基的能力較強，清除率IC50分別為0.46 mg/mL和2.95 mg/mL，其對羥基自由基的清除能力優(yōu)于谷胱甘肽。本研究所優(yōu)化的提取工藝簡便，穩(wěn)定，可行，提取率高，且所提取的總黃酮具有抗氧化活性，為瓊辣蓼總黃酮的提取及抗氧化應(yīng)用提供實驗依據(jù)。